姜黄素对人支气管上皮细胞MMP-9表达的影响

韦丽玲 朱美飞 黄立权 江荣林 王灵聪

·论 著·

姜黄素对人支气管上皮细胞MMP-9表达的影响

韦丽玲 朱美飞 黄立权 江荣林 王灵聪

目的 观察姜黄素（Cur）对人支气管上皮细胞（HBECs）MMP-9表达的影响。方法 体外培养人支气管上皮细胞，分为空白组、LPS组及LPS+姜黄素（Cur）组，其中LPS浓度为10μg/mL，姜黄素组在相同浓度LPS刺激下又各分为5、10、20、40和80μmol/L五个浓度组，作用4h后在显微镜下观察细胞形态变化，采用实时荧光定量PCR观察人支气管上皮细胞MMP-9 mRNA表达量。结果 显微镜下观察姜黄素（Cur）干预后HBECs细胞形态良好，无明显损伤。RT-PCR结果显示，空白组可见一定量MMP-9 mRNA表达（1.00124±0.12918）；与空白组比较，LPS组人支气管上皮细胞MMP-9 mRNA表达量明显增加［（1.75204±0.18837）比（1.00124±0.12918），P＜0.05］，80μmol/L Cur组亦可增加MMP-9 mRNA表达［（1.99646±0.39105）比（1.00124±0.12918），P＜0.05］。与LPS组比较，10μmol/L Cur组人支气管上皮细胞MMP-9 mRNA表达量显著下降［（0.67958±0.17142）比（1.75204±0.18837），P＜0.05］，5、20、40μmol/L Cur对支气管上皮细胞MMP-9mRNA表达无明显作用（P＞0.05）。结论 10μmol/L姜黄素（Cur）可降低人支气管上皮细胞MMP-9mRNA表达。

人支气管上皮细胞；姜黄素；MMP-9

基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）是一类锌离子活性依赖、结构高度同源、主要作用于细胞外基质的蛋白水解酶大家族，MMP-9为成员之一，属其亚型的明胶酶一族，又称明胶酶B。它不仅可以降解变性胶原，还可降解多种细胞外基质成分，包括IV型胶原、纤维黏连蛋白、层黏连蛋白等。MMP-9可在多种细胞中表达，除了常见的炎症细胞如巨噬细胞和中性粒细胞外，一些结构细胞在刺激下也可产生，如支气管上皮细胞（human bronchialepithelial cells，HBECs）、成纤维细胞、平滑肌细胞及内皮细胞等。近年研究显示，多种细胞因子可刺激支气管上皮细胞分泌MMP-9并参与气道重建[1-2]，而脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）作为致病菌的有效成分可以刺激细胞产生多种炎症介质，促使MMP-9的表达。研究[3-4]表明，姜黄素（curcumin，Cur）可抑制炎症因子的表达。本实验拟体外培养观察LPS作用下Cur对人支气管上皮细胞（human bron-chial epithelial，HBECs）MMP-9表达的影响。

1 实验材料

1.1 细 胞 人支气管上皮细胞株BESA-2B，由中国科学院典型培养物保藏中心昆明细胞库提供。

1.2 药品及试剂 姜黄素（SIGMA，批号 BCBL 0424V）；LPS（SIGMA，批号 122M40010）；动物总RNA快速提取试剂盒（上海捷瑞生物工程有限公司）；逆转录试剂盒RevertAid First Strand cDNA synthesis Kit（Thermo Scientific Fisher公司）；qPCR试剂盒SuperRealPreMix Plus（SYBR Green)（TIANGEN公司）。

1.3 仪 器 二氧化碳培养箱、3111型和微量加样器（均为Thermo公司）；倒置荧光显微镜（江南公司）；台式低速离心机（80-2型，上海医疗器械（集团）有限公司）；细胞培养瓶、细胞培养板（均为Corning公司）；超净工作台（苏州净化）；OD值测量仪器（Merinton SMA4000）；定量PCR仪（M允Mini Personal Thermal Cycler，配套使用的分析软件为BIORAD CFX Manager）；相关耗材如Tip头、EP管等（Thermal Scientific Fisher公司，均为无 RNase、DNase和无热源的分子生物学耗材）。

2 实验方法

2.1 细胞培养和分组 复苏BEAS-2B细胞，用LHC-8无血清培养基，37℃、5%CO2培养箱孵育培养，使用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗，0.125%Trypsin+ 0.01%EDTA消化细胞进行传代培养并调整细胞状态。待细胞传代一定程度，取对数生长期细胞，0.125%Trypsin+0.01%EDTA消化离心，计数后，以2× 105/well铺6孔板，37℃、5%CO2培养箱孵育培养。24h后，将细胞分为空白组、LPS（10μg/mL）组、同浓度LPS+Cur各组（5μmol/L Cur组，10μmol/L Cur组，20μmol/L Cur组，40μmol/L Cur组和80μmol/L Cur组），作用4h。取Cur干预4h后的细胞放在倒置显微镜下观察其形态变化。

2.2 RT-PCR法检测MMP-9mRNA表达 细胞处理完毕，用Trizol法按照动物总RNA快速提取试剂盒说明提取总RNA并反转录为cDNA，将其加入到PCR体系中进行扩增。扩增反应体系为：2×SuperRe alPreMix Plus，10μL；Forward primer，5μM：0.6μL；Reverse primer，5μM：0.6μL；cDNA模板（加dd H2O稀释成7ng/μL∶8.8μL；总计20μL。MMP-9引物上游：5'-TTTGAGTCCGGTGGACGATG-3'，下游引物：5'-GCTCCTCAAAGACCGAGTCC-3'，产物大小为197bp。β-actin引物上游：5'-GACTTAGTTGCGTTACACCCTTTC-3'，下游引物：5'-GACTGCTGTCACCTTCACCGT-3'，产物大小为163bp。扩增条件：95.0°C，3min；95.0°C，10s；59.0°C，20s；72.0°C，30s。共51个循环。

2.3 统计学方法 应用SPSS17.0统计软件进行数据处理，实验数据以均数±标准差（±s） 表示，各组间均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 显微镜下细胞形态变化 人支气管上皮细胞经Cur干预后，在显微镜下可观察到多数细胞形态良好，细胞无明显损伤，见图1（封二）。

3.2 各组人支气管上皮细胞MMP-9mRNA表达实时荧光定量PCR扩增结果显示，空白组可见一定量MMP-9mRNA表达，与空白组比较，LPS组MMP-9 mRNA表达量明显增加（P＜0.05），80μmol/L Cur组亦可增加MMP-9 mRNA表达（P＜0.05）。与LPS组比较，10μmol/L Cur组MMP-9mRNA表达量显著下降（P＜0.05），5、20、40μmol/L的Cur对支气管上皮细胞MMP-9mRNA表达无明显作用（P＞0.05），见表1。基因扩增曲线见图2（封二）。

表1 各组人支气管上皮细胞MMP-9mRNA表达量比较（±s）

表1 各组人支气管上皮细胞MMP-9mRNA表达量比较（±s）

注：与空白组比较，*P＜0.05；与LPS组比较，△P＜0.05；LPS：脂多糖；Cur：姜黄素

?

4 讨 论

近年国内外的研究显示，支气管上皮细胞在多种体内、外因素的作用下大量表达MMP-9。Hozumi等[1]发现TNF-α可诱导人支气管上皮细胞分泌MMP-9，其信号传导过程由NF-κB途径介导；另一项研究亦发现TNF-α、刀豆素A及机械刺激人支气管上皮细胞可导致MMP-9表达和分泌[5]。LPS是革兰氏阴性菌细胞壁的一种成分，可介导细胞表达分泌MMP-9。研究[6]表明，LPS是MMP-9强诱导剂，在mRNA及蛋白水平上诱导其高表达，且诱导作用与LPS的浓度和时间呈依赖性，Ma等[7]通过实时PCR及Westblot结果显示，在肺损伤模型6h后的肺组织中，LPS组MMP-9mRNA和蛋白表达量较对照组显著增加，明胶酶谱检测MMP-9活性亦明显提高。Cheng等[8]发现在H9c2心肌母细胞株中LPS通过ERK1/2信号通路能上调uPA、MMP-2、MMP-9的表达。LPS作为致病菌的主要致病成分，能激活多种细胞分泌诸如TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8等细胞因子，进而激活NF-κB等信号通路途径引起MMP-9分泌释放。目前已经证实，MMP-9基因启动子上存在NF-κB、AP-1等核因子的结合位点，TNF-α、IL-1β、IL-6等细胞因子可通过这些核因子的激活而调节MMP-9的表达。本实验中空白对照组支气管上皮细胞有少量MMP-9 mRNA表达，经LPS刺激后，与空白组比较，MMP-9 mRNA表达量明显上升（P＜0.05），说明人支气管上皮细胞在经LPS刺激后，激活一系列细胞因子，这些细胞因子经过核因子-κB途径调节细胞大量产生MMP-9。

姜黄素（curcumine）为姜黄的天然色素，目前已作为一种有多种功效的药物而广泛应用于临床。中医认为，姜黄具有行气、活血散风和通络止痛功效。近年研究证实姜黄素能抗氧化、抗感染、抗凝、降血脂、防动脉粥样硬化和抑制肿瘤生长。张筠等[9]发现姜黄素能明显降低TNF-α诱导的人脐静脉内皮细胞MMP-9的表达，与Yu等[10]观察姜黄素通过下调NF-κB抑制MMP-9表达阻碍TNF-α诱导人动脉平滑肌细胞移行的报道一致。而ERK1/2通路在信号传递中亦发挥作用，研究[8]发现，使用ERK1/2抑制剂后能减少MMP-9表达，并降低后者活性。我们前期研究[11]也发现姜黄素能降低APE大鼠肺ERK、PI3K、Akt水平，抑制其通道，从而减少TNF-α、IL-1β、IL-6等细胞因子的释放，减轻肺组织损伤。本研究结果显示，扩增曲线提示扩增多在20～40之间，符合要求；与LPS组比较，Cur各浓度组对人支气管上皮细胞MMP-9 mRNA表达的抑制强度并不呈浓度依赖性，5、20、40μmol/L Cur组对LPS诱导下的支气管上皮细胞作用不佳（P＞0.05），而10μmol/L Cur组作用最显著，能明显抑制支气管上皮细胞MMP-9 mRNA表达（P＜0.05）。据此推测，10μmol/L Cur通过下调TNF-α等细胞因子的表达激活而抑制ERK1/2和核因子-κB的信号通路，减少支气管上皮细胞MMP-9 mRNA表达，在显微镜下也能观测到Cur干预后细胞形态良好，未见明显损伤。而80μmol/L Cur组与空白组比较，Cur未见抑制作用，反而增加了MMP-9 mRNA表达量，提示大剂量Cur不仅不会提高疗效，可能还会存在潜在的细胞毒风险，而产生相反的效果。

综上所述，Cur对人支气管上皮细胞MMP-9 mRNA表达有抑制作用，以浓度10μmol/L的Cur效果最佳，其作用机制可能与细胞因子释放激活相应信号通路有关，有待进一步研究阐释其过程。

［1］Hozumi A，Nishimura Y，Nishiuma T，et al.Induction of MMP-9 in normal human bronchial epithrlial cells by TNF-αvia NF-κB-mediated pathway［J］.Am允Physiol Lung Cell Mol Physiol，2001，281（6）：L1444-L1452.

［2］Urpo L，允effrey AW，Susan EW，et al.Interleukin-1βcauses pulmonary inflammation,emphysema，and airway remodeling in the adult murine lung［J］.Am允Respir Cell Mol Biol，2005，32（4）：311-318.

［3］王灵聪，张微，夏国莲，等.姜黄素对急性肺血栓大鼠炎症因子的影响［J］.中医杂志，2013，54（6）：504-506.

［4］Zhe M,Chao Y,Qian D,et al.Curcumin inhibits LPS-induced inflammation in rat vascular smooth muscle cells in vitro via ROS-relative TLR4-MAPK/NF-κB pathways［J］.Acta Pharmacologica Sinica，2013，34（7）：901-911.

［5］韩照升，钟南山.肿瘤坏死因子-α、刀豆素A及机械损伤刺激人支气管上皮细胞系H292表达基质金属蛋白酶-9［允］.中国病理生理杂志，2002，18（7）：741-744.

［6］路军，阮秋蓉，康苏娅.脂多糖对血管平滑肌细胞表达MMP-9的影响及可能机制［J］.中国血液流变学杂志，2006，16（4）：514-516.

［7］Ma B，Zhou PY，Ni W，et al.Inhibition of activin receptorlike kinase 5 induces matrix metallopeptidase 9 expression and aggravates lipopolysaccharide-induced pulmonary injury in mice［J］.European Review for Medical and Pharmacological Sciences，2013，17（8）：1051-1059.

［8］Cheng YC，Chen LM，Chang MH，et al.LipopolysaccharideupregulateuPA，MMP-2 and MMP-9 via ERK1/2 signaling in H9c2 cardiomyoblast cells［J］.Mol Cell Biochem，2009，325（1-2）：15-23.

［9］张筠，王宗仁，刘镘利.姜黄素对人脐静脉内皮细胞损伤模型MMP-9表达的抑制作用［J］.中国中医急症，2008，17（4）：510-512.

［10］Yu YM，Lin HC.Curcumin prevents human aortic smooth muscle cells migration by inhibiting of MMP-9 expression［允］.Nutrition Metabolism&Cardiovascular Diseases，2010，20（2）：125-132.

［11］王灵聪，张微，吴建浓，等.姜黄素对急性肺栓塞大鼠细胞外调节蛋白激酶、三磷酸肌醇激酶、蛋白激酶B的影响［J］.中医杂志，2013，54（18）：1592-1595.

（收稿：2014-11-24 修回：2015-05-07）

Effects of Curcumin on the Expression of MMP-9 in Human Bronchial Epithelial Cells

WEI Liling,ZHU Meifei,HUANG Liquan,允IANG Ronglin,WANG Lingcong. ICU,First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310006),China

Objective To investigate the effect of curcumin（cur）on the expression of matrix metalloproteinase 9（MMP-9）in human bronchial epithelial cells（HBECs）.Methods HBECs was cultured in vitro and divided into blank group,LPS group and cur groups.LPS group was set at 10μg/mL and cur groups were set at 5 concentrations of 5,10,20,40,80μmol/L after the stimulation of the same LPS concentration.Morphological changes of HBECs were observed through a microscope after cur intervention and real-time quantitative PCR was performed to examine the dynamic expression of MMP-9 in HBECs after 4h.Results The morphology of cells were well maintained in absence of significant damage after cur intervention.Real-time PCR results showed that blank group produced a certain amount of MMP-9 mRNA expression（1.00124±0.12918）and that LPS group and cur group with 80μmol/L concentration had significantly increased expression of MMP-9 mRNA in HBECs（1.75204±0.18837 and 1.99646±0.39105 vs blank group,P＜0.05）.Compared with LPS group,cur group with 10μmol/L concentration had decreased MMP-9 mRNA exepression in cells（0.67958±0.17142,P＜0.05）,but other cur groups（5,20,and 40μmol/ L）had no marked effect on the expression of MMP-9 in HBECs（P＞0.05）.Conclusion Curcumin of 10μmol/L can lower the expression of MMP-9 mRNA in HBECs.

human bronchial epithelial cells;curcumin;MMP-9

浙江省卫生高层次创新人才培养工程项目资助，浙江省自然科学基金（No.Y207052，LY12H29005）

浙江中医药大学第一临床医学院ICU（杭州 310006）

王灵聪，E-mail：wlc501@139.com；Tel：（0571）86620356