急性髓系白血病患者骨髓单个核细胞中WT1表达及其与疗效、预后的关系

李凌浩，王智，陆时运，赵晓红，周仲昊，王晨

(南京医科大学附属无锡第二医院，江苏无锡214002)

Wilms基因(WT1)最早于1990年由 Call等［1］在Wilms瘤中发现，其定位于人类染色体11p13，编码产物为一锌指转录因子。近年研究发现，WT1可调控造血细胞增生和(或)分化基因的转录或激活，与急性髓系白血病(AML)等多种肿瘤性疾病密切相关。近年来，WT1在AML患者中的表达及其与疾病的发生、发展和预后的关系受到广泛关注。2010年1月～2013年12月，我们观察了AML患者骨髓单个核细胞中WT1表达水平，并分析其与患者临床特征、疗效及预后的关系。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 同期选择我院收治的初发AML患者56例，男30例、女26例，年龄23～85岁。同期另选非肿瘤患者28例，男17例、女11例，年龄34～78岁，其中营养性贫血12例、感染8例、免疫性血小板减少性紫癜8例。两组性别、年龄具有可比性。所有研究对象符合《血液病诊断及疗效标准》［2］中的相应诊断标准。

1.2 WT1检测 收集所有研究对象的抗凝骨髓液2 mL，经红细胞裂解液处理后得到单个核细胞，TRIzol液裂解，提取总RNA，经分光光度仪定量调整RNA 浓度至 0.5 μg/μL。合成 cDNA:配置 40 μL反应体系:随机引物 2 μL、RNA 4 μL、5 × Buffer液8 μL、逆转录酶 1.5 μL、RNA 酶抑制剂 0.6 μL、dNTP 0.5 μL、DEPC 水 23.4 μL，混匀后置于 PCR仪内，反应条件:37℃ 1 h、95℃ 5 min、4℃长期，得到cDNA产物。采用实时定量聚合酶链反应(QTPCR)，所有引物和探针由上海生物工程技术有限公司合成。根据文献［3］设计WT1、ABL基因引物和探针及设置反应条件，将WT1、ABL基因已知阳性模板进行倍比稀释制作标准曲线，待测样本中各基因量根据其CT值从标准曲线上读出，每份标本检测3次取平均值，以WT1拷贝数/10 000ABL拷贝数作为待测标本WT1基因表达量。判定标准:WT1参照欧洲白血病网标准［4］，以250拷贝数/10 000 ABL拷贝数为界分为高表达组和正常表达组。

1.3 治疗方案及效果评价 所有初诊AML患者接受标准诱导缓解化疗方案，包括DA方案(柔红霉素45 mg/m2第1～3天，阿糖胞苷150 mg/m2第1～7天)或IA方案(去甲氧柔红霉素8 mg/m2第1～3天，阿糖胞苷150 mg/m2第1～7天)。参照文献［2］评价疗效，包括完全缓解(CR)、无事件生存(EFS)时间、总生存(OS)时间。

1.4 统计学方法 采用SAS8.1统计软件。EFS、OS比较采用Wilcoxon检验，CR率比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 AML与非肿瘤患者骨髓单个核细胞中WT1表达水平比较 56例AML患者骨髓单个核细胞中WT1表达水平为(10～19 733)拷贝/10 000 ABL拷贝，中位数为2 875拷贝/10 000 ABL拷贝;高表达48例，正常表达8例。28例非肿瘤患者骨髓单个核细胞中WT1表达水平全部＜10拷贝/10 000 ABL拷贝，中位数为8拷贝/10 000 ABL拷贝;无高表达病例。AML患者骨髓单个核细胞中WT1表达水平明显高于非肿瘤患者(P＜0.01)

2.2 不同WT1表达的AML患者临床特征 不同WT1表达水平的AML患者年龄、外周血白细胞数量、骨髓原幼细胞比例、LDH水平比较差异均无统计学意义。见表1。

表1 不同WT1表达水平AML患者临床特征［中位数(95%CI)］

2.3 AML患者WT1表达水平与其他临床指标的关系 见表2。

表2 不同WT1表达水平AML患者临床指标比较(例)

2.4 AML患者不同WT1表达水平与疗效及预后关系 首次诱导化疗后，正常表达组CR 6例，高表达组CR 31例，两组CR率比较差异无统计学意义(P＞0.05)。正常表达组EFS时间3～33个月、中位EFS时间22个月，高表达组EFS时间0.5～35个月、中位EFS时间15个月，两组EFS时间比较差异无统计学意义(P＞0.05)。正常表达组OS时间7～38个月、中位OS时间29.5个月，高表达组OS时间1～40个月、中位OS时间19个月，两组OS时间比较差异有统计学意义(P＜0.05)。

3 讨论

研究显示，WT1具有增强或抑制目的基因转录的作用，其目的基因可进一步参与细胞的生长及分化。最初 WT1被作为一种抑癌基因，但近年在AML的研究中发现，其具有致癌作用［5］，目前已作为一种新的AML指标被人们关注。

研究显示，AML患者普遍存在WT1高表达。本研究中，AML患者WT1表达水平明显高于非肿瘤患者，AML患者中WT1高表达者占85.7%(48/56)，与以往报道一致。研究结果显示，WT1表达水平的高低与患者性别、年龄、外周血白细胞数量、骨髓原幼细胞比例无关，与Yang等［5］报道一致。本研究还发现，WT1表达水平的高低与血清LDH水平亦无相关性，提示其为一种独立于以上指标的新的AML临床指标。

本研究结果显示，WT1表达正常者与WT1高表达AML患者首次诱导化疗后CR率相当，但WT1表达正常AML患者EFS、OS时间更长。提示AML骨髓单个核细胞中WT1表达正常者可能获得更好的疗效和预后。目前，有关WT1表达水平与AML患者疗效间的关系尚存在争议，多数学者认为WT1高表达者预后较差［6～12］，也有学者认为 WT1表达水平对预后无指导意义或预后较好［13～15］。关于WT1在AML中预后意义的不同研究结果可能与患者数量、多种其他预后因素影响、WT1基因突变及众多WT1亚型等复杂因素有关，其能否成为AML的独立预后指标还有待商榷。

综上所述，AML患者骨髓单个核细胞WT1水平较非肿瘤患者明显高表达;AML患者WT1表达水平与患者性别、年龄、外周血白细胞数量、骨髓原幼细胞比例、血清LDH水平无关，可能与疗效、EFS时间、OS时间有关，尚需进一步扩大样本量加以验证。

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