盐酸曲美他嗪预处理对大鼠肾脏急性缺血再灌注损伤的影响

杜艺，钱白音，魏玉婷，李素霞，李宓

(中山大学附属第五医院，广东珠海519000)

盐酸曲美他嗪(TMZ)在心肌缺血时能抑制脂肪酸的β氧化、促进葡萄糖氧化利用，改善心肌细胞能量代谢［1］，目前广泛用于缺血性心脏病的治疗。研究发现，肾脏和心肌缺血再灌注损伤(IRI)均存在三磷酸腺苷产生不足、氧自由基大量产生、胞内钙超载等机制［2～4］;TMZ可通过上述途径对心肌细胞产生保护作用，但其在肾脏IRI时是否具有相同的保护作用报道较少。2012～2014年我们观察了TMZ对大鼠肾脏IRI的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 健康雄性SD大鼠90只(中山大学实验动物中心)，15周龄，体质量(236±10)g;TMZ(法国施维雅药厂)，血清尿素氮(BUN)、肌酐(SCr)、IL-18、中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)试剂盒(南京建成生物工程研究所)，721分光光度计(上海精密科学仪器公司)，光学显微镜(日本Olympus公司)。

1.2 动物分组与模型制作 随机将大鼠分为A、B两组各45只，适应性喂养2 d，温度约为23℃，湿度60%，12 h交替照明，自由饮水、饮食。第3天，A组给予生理盐水稀释的TMZ 10 mg/(kg·d)灌胃5 d，再随机分为缺血再灌注(IR1)组、缺血再灌注后处理(IPO1)组、假手术(S1)组，每组15只。B组大鼠生理盐水灌胃，生理盐水用法、用量同TMZ，再随机分为缺血再灌注(IR2)组、缺血再灌注后处理(IPO2)组、假手术(S2)组，每组15只。参考Basile等［5］的方法制备缺血再灌注的急性肾损伤动物模型。缺血再灌注后处理(IPO):在缺血45 min后用血管夹同时给予双侧肾脏恢复血供20 s、阻断血供20 s处理，反复10次后恢复血供。假手术组:手术方法同上，但仅分离出大鼠双侧肾动脉，不进行夹闭。手术后肉眼观察肾脏恢复灌注，除在0 h时取标本组没有缝合腹腔，剩余大鼠均逐层缝合腹腔。各组缺血过程保持大鼠肛温在36.5～37.0℃。

1.3 血清BUN、SCr、NGAL、IL-18水平检测 分别在末次恢复肾脏血供0、6、12、24、48 h，取 A、B 组缺血再灌注、IPO大鼠各3只分别经眶后静脉丛采集静脉血2～3 mL，离心(3 000 r/min)15 min，取血清于-20℃保存，待测SCr、BUN。化学比色法检测血BUN、SCr;应用ELISA法测定NGAL、IL-18。并在末次恢复肾脏血供0 h取假手术组大鼠血清检测BUN、SCr、NGAL、IL-18。

1.4 肾脏组织形态学观察 在各时间点取血清标本后脊椎脱臼法处死大鼠，开腹，迅速摘除肾脏，用冰浴生理盐水冲洗后，经肾门处横断面切一片厚度为2～3 mm的组织片，用100 mL/L甲醛固定，常规脱水、包埋、切片后，行HE和PAS染色。光镜下观察形态，参考Paller等［6］的方法进行评分，随机选择10个无重叠视野(×200)，每个视野下随机选择10处肾小管，共100处肾小管计分，分数越高表示肾小管损伤程度越严重。

1.5 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件。计量资料以±s表示，采用完全随机设计的单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组不同时间血BUN、SCr、NGAL、IL-18水平及肾小管损伤程度评分比较 见表1。

2.2 各组肾形态学变化 S1、S2组肾小球和肾小管未发现明显异常;IR1、IR2组肾小管上皮细胞混浊肿胀、空泡变性，肾小管明显扩张，上皮细胞发生变性、坏死，间质充血水肿，基底膜断裂;IPO1、IPO2组肾小球囊腔增宽，只见部分肾小管有轻度肿胀、变性，肾小管扩张及坏死程度均减轻。

3 讨论

急性肾脏IRI多见于低血容量性休克、急性肾动脉阻断以及肾脏移植、肾挤压伤、体外震波碎石等情况，可以造成急性肾损伤或使移植肾功能延迟恢复。此外，它也是肾水平以上主动脉手术和急性肾衰的一种常见而又可危及患者生命的并发症。因此，如何有效防止因急性肾脏IRI而导致的各种急慢性肾脏疾病是一个亟待解决的问题［7］。在肾脏IRI的防治中，丙泊酚、P选择素单克隆抗体、N-去硫酸肝素等虽有报道［8］，但并未得到广泛认可和应用，急性肾脏IRI早期药物治疗一直在探索之中，但现阶段主要治疗手段仍是肾脏替代治疗，尤其是持续肾脏替代治疗。

TMZ是第一个长链3-酮酰基辅酶A硫解酶抑制剂。研究表明，它不仅能通过增强葡萄糖氧化代谢、恢复糖酵解和碳水化合物之间的偶联，在耗氧较少的情况下产生三磷酸腺苷，同时还可以减轻心肌细胞内酸中毒和高钙血症、限制炎症反应以及减少氧自由基生成等抗IRI，并能降低心脏交感神经活性，目前已广泛应用于缺血性心脏病的治疗［9～11］。

IPO是临床治疗IRI的重要手段，如在冠心病的治疗、器官移植中的运用［12］。急性肾IPO对IRI的保护作用已经得到公认，本实验与急性肾IPO对肾脏的保护作用做对比，进一步观察TMZ的保护作用。结果显示，IR1组与IPO1组比较，各时间点各指标比较差异均无统计学意义;IR1组与IR2组比较，在6 h时IR2组的NGAL、IL-18、肾小管损伤程度评分明显上升;12 h时BUN开始明显上升，24 h时IR2组的各项指标均显著高于IR1组，48 h时BUN、SCr仍显著高于IR1组。IPO1组与IPO2组比较，在6 h时IPO2组的NGAL明显上升，12 h时除SCr外均有上升，24 h时除NGAL外其他指标均高于IPO1组，48 h时BUN、SCr、肾小管损伤程度评分仍显著高于IPO1组。说明在实验前使用SMZ可以减轻肾IRI的程度。同时还发现，IR1组与IPO2组比较，在6 h时IPO2组NGAL明显上升，12 h时除SCr外其他指标均显著高于IR1组，48 h时SCr仍显著高于IR1组。提示实验前使用SMZ可获得与缺血后处理相似的效果。综上所述，在IRI发生前即预防性使用TMZ可以减轻肾功能损伤。

表1 各组不同时间血清BUN、SCr、NGAL、IL-18水平及肾小管损伤程度评分比较(±s)

表1 各组不同时间血清BUN、SCr、NGAL、IL-18水平及肾小管损伤程度评分比较(±s)

注:与同组中S1组或S2组比较，*P＜0.05;与IR2组同时间点比较，#P＜0.05;与IPO2组同时间点比较，△P＜0.05;与IPO2组同时间点比较，▽P＜0.05。

组别 BUN(mmol/L) SCr(μmol/L) NGAL(pg/mL) IL-18(pg/mL) 肾小管损伤程度评分(分A 组IR1组0 h 12.03±3.33 27.81±5.78 67.14± 9.96 489.13±22.03 33±11 6 h 17.56±6.11* 28.01±3.79 160.98±11.34*#▽ 580.23±23.63*#▽ 58±16*#12 h 27.11±2.01*#▽ 26.43±5.23 246.88±20.05*#▽ 828.53±39.01*#▽ 150±36*#▽24 h 30.71±1.93*# 29.55±4.07#▽ 128.42±19.73*#▽ 724.33±17.88*#▽ 322±32*#▽48 h 12.54±1.91#▽ 24.83±6.51#△▽ 70.05± 9.34 490.43±17.56 390±22*IPO1组0 h 12.89±2.56 27.88±5.06 67.14± 9.99 508.89±22.87 32±12 6 h 18.44±6.01* 28.16±3.33 120.27±10.55＊△ 602.23±17.32* 50±14*12 h 20.21±2.04＊△ 28.67±4.99 239.57±19.88＊△ 783.28±19.77＊△ 111±23＊△24 h 21.44±1.63＊△ 28.98±3.33△ 144.32±16.78* 553.23±16.53＊△ 342±19＊△48 h 11.34±1.67#△ 27.53±5.67#△ 82.34± 8.23 550.21±15.54 300±12＊△S1组 12.09±2.03 25.31±4.74 65.09±10.56 487.04±21.09 33±12 B组IR2组0 h 13.39±2.34 27.31±5.61 68.79± 9.67 489.54±23.88 30±10 6 h 17.74±6.17* 28.87±3.83 226.78±11.53* 639.23±23.63* 72±16*12 h 40.18±3.21* 28.24±6.03 384.76±28.93* 1113.54±27.71* 222±12*24 h 41.55±1.88* 50.66±3.77* 285.47±16.34* 932.56±19.99* 553±32*48 h 22.54±1.93* 45.36±6.51* 80.05± 9.66 513.37±16.85 408±27*IPO2组0 h 13.87±3.01 27.54±4.98 69.19±11.23 473.34±22.88 29±13 6 h 18.31±5.02* 28.34±4.07 180.23± 7.99* 627.08±14.37* 50±12*12 h 32.17±3.33* 26.13±6.84 309.73±26.54* 913.01±25.55* 220±21*24 h 29.53±1.80* 43.77±3.01* 174.93±15.22* 799.51±23.22* 423±27*48 h 19.54±1.91* 38.36±5.53* 79.05±13.01 522.83±16.37 380±32*S2组 11.69±2.15 27.34±5.69 67.98±12.37 458.15±20.77 29±10

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