苦参素对肺癌A549细胞的放疗增敏作用及其机制

史卫林，李坚，陆建保，陈萍，陈康

(1溧阳市人民医院，江苏溧阳213300;2江苏大学附属医院)

近年来，肿瘤的放疗技术已取得了较大进展，但仍有部分患者因放射抵抗而导致放疗失败，究其原因主要与肿瘤细胞对放射线耐受有关，故寻找对放疗有增敏作用的药物成为肿瘤治疗领域研究的一个热点。苦参素是中药苦参的主要活性成分之一，主要从苦参根及苦豆子中提取，具有抗炎、免疫抑制、抗肿瘤、抗病毒、抗心律失常等作用［1］，也有少量研究表明其有放疗增敏作用［2］，但是增敏机制尚不清楚。2014年3月～2015年3月，我们观察了苦参素对肺癌A549细胞的放疗增敏作用，并探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 DMEM培养基、0.25%胰蛋白酶(Gibco公司)，苦参素标准品(北京中科仪友化工技术研究院)，CCK-8试剂盒(生工生物工程上海股份有限公司)，TRIzol试剂盒(Invitriogen公司)，逆转录试剂盒、荧光定量 PCR试剂盒(TaKaRa公司)，DNA PKcs兔抗人单克隆抗体(abcam公司)，β-actin鼠抗人单克隆抗体(Santa Cruz公司)，辣根过氧化物酶标记羊抗鼠/兔二抗(BD公司)，发光剂(Millipore公司)，倒置式生物显微镜(Olympus公司)，Clinac 600c 6MV X射线(Varian公司)，HT-2型酶标仪(Austria公司)，超声破碎仪(Misonix公司)，蛋白电泳仪(Bio-Rad公司)，凝胶成像及分析系统(北京赛智创业科技有限公司)，荧光定量 PCR分析仪(Stratagene公司)，人肺腺癌细胞株 A549由江苏大学医学院提供。

1.2 肺癌A549细胞增殖检测 采用CCK-8法。体外培养肺癌A549细胞，取对数生长期细胞接种于96孔板，每孔100 μL(每孔约5×103个细胞)。培养12 h后移液枪小心吸取上清，将含有0.5、1.0、2.0、4.0 g/L苦参素的培养基100 μL加入对应的孔(实验组)中，同时设立空白组和阴性对照组，每孔设6个复孔。置于37℃、5%CO2培养箱孵育，分别在培养24、48 h于对应的各孔中加CCK-8试剂10 μL，继续培养1 h后，在酶标仪上于450 nm处测定吸光度A值。重复测量3次，取平均值。用空白组调零后，计算各组细胞增殖率(细胞增殖率=实验组A值/对照组A值×100%)。

1.3 Ku70 mRNA表达检测 采用实时荧光定量RT-PCR法。根据细胞抑制率(细胞抑制率=1-细胞增殖率)，采用SPSS11.5统计软件计算48 h时苦参素的 IC20值，并以此作为加药浓度［3，4］。取对数生长期肺癌A549细胞，随机将肺癌A549细胞分为对照组、单纯药物组、单纯放疗组(2 Gy)、药物联合放疗组。各组在苦参素和(或)放疗干预48 h后，收集细胞，使用TRIzol试剂提取RNA，测定RNA浓度，然后进行逆转录，最后PCR扩增。扩增条件:95℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40个循环。引物序列由上海捷瑞生物工程有限公司合成。GAPDH:上游引物:5＇-CGCTGAGTACGTCGTGGAGTC-3＇，下游引物:5 ＇-GCTGATGATCTTGAGGCTGTTGTC-3 ＇，产物长度172 bp;Ku70:上游引物:5 ＇-CTCTTGGCTGTGGTGTTCTATGGTA-3＇，下游引物:5＇-TGAGTGAGTAGTCAGATCCGTGGC-3＇，产物长度187 bp。以GAPDH作为内参照，定量分析Ku70 mRNA的相对表达水平。计算公式

1.4 Ku70蛋白表达检测 采用Western blotting法。分组及苦参素和(或)放疗干预同1.3。各组在苦参素和(或)放疗干预48 h后，裂解细胞，提取蛋白，采用蛋白试剂盒测定浓度，样品变性，将蛋白通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，转印至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，5%脱脂奶粉封闭，加入稀释的一抗4℃孵育过夜，辣根过氧化物酶二抗孵育后将PVDF膜置于凝胶成像及分析系统暗室中，滴加ECL发光剂，曝光显示条带。使用Lane 1D凝胶电泳图像分析系统分析条带的灰度，以Ku70/β-actin表示Ku70蛋白的相对表达量。

1.5 统计学方法 采用SPSS11.5统计软件。计量资料以±s表示，多组比较采用方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度苦参素对肺癌A549细胞增殖率的影响 A549细胞经不同浓度苦参素处理后，细胞增殖率随苦参素作用时间的延长及浓度的增大而下降，呈时间依赖性和剂量依赖性。4种浓度的苦参素作用后细胞增殖率见表1。

表1 不同浓度苦参素处理后A549细胞增殖率(±s)

表1 不同浓度苦参素处理后A549细胞增殖率(±s)

注:与0.5 g/L比较，*P＜0.05;与1.0 g/L比较，#P＜0.05;与2.0 g/L比较，△P＜0.05;与同浓度24 h比较，▼ P＜0.05。

细胞增殖率24 h 48 h苦参素浓度0 g/L(阴性对照组)1.000±0.000 1.000±0.000 0.5 g/L 0.908±0.036 0.892±0.039▼1.0 g/L 0.836±0.043* 0.786±0.024*▼2.0 g/L 0.651±0.060*# 0.588±0.026*#▼4.0 g/L 0.375 ±0.098*#△ 0.297 ±0.149*#△▼

2.2 各组肺癌A549细胞Ku70 mRNA及蛋白表达水平比较 肺癌A549细胞经苦参素处理后48 h的IC20值为0.9 g/L。以此为加药浓度，各组干预48 h后Ku70 mRNA及蛋白表达比较见表2。单纯放疗组中Ku70 mRNA及蛋白的相对表达水平与对照组比较明显增高(P＜0.05)。单纯药物组、药物联合放疗组的Ku70 mRNA及蛋白相对表达水平均明显低于同等照射剂量的对照组及单纯放疗组(P＜0.01)。

表2 各组A549细胞处理48 h时Ku70 mRNA及蛋白的相对表达水平比较(±s)

表2 各组A549细胞处理48 h时Ku70 mRNA及蛋白的相对表达水平比较(±s)

注:与对照组比较，*P＜0.05;与单纯药物组比较，#P＜0.05;与单纯放疗组比较，▼P＜0.01。

组别 n Ku70 mRNA Ku70蛋白对照组6 1.00±0.000 1.20±0.232单纯放疗组 6 3.64±1.147* 1.33±0.424*单纯药物组 6 0.87±0.280*▼ 0.76±0.176*▼药物联合放疗组 6 0.64±0.265*#▼ 0.62±0.156*#▼

3 讨论

DNA是放射线作用的主要靶点，放射线的直接作用和电离效应产生的自由基共同导致DNA单、双链断裂损伤，以双链断裂损伤最为重要。当DNA双链受到损伤时，细胞将通过不同的通路启动应答进行损伤修复。在哺乳动物细胞中，双链断裂损伤修复有两条通路:同源重组和非同源末端连接(NHEJ)，其中NHEJ通路在双链断裂损伤修复中可能起主要作用［5］。人Ku70基因位于染色体22q13，编码609个氨基酸，相对分子质量为69 kD，它与Ku80通过非共价键紧密结合形成的异源二聚体结构称为Ku蛋白［6］。研究证实，Ku蛋白是DNA依赖蛋白酶(DNA-PK)复合物的主要功能单位，而DNA-PK复合物是DNA双链断裂损伤修复过程中的关键蛋白激酶，在整个NHEJ过程中具有重要作用［7］。因此，Ku70是目前研究肿瘤细胞放疗敏感性的主要靶点之一。

苦参素(氧化苦参碱)是传统中药苦参的主要生物活性成分之一，来源于豆科植物苦参的干燥根。近年研究发现，苦参素有多方面的药理活性，其中抗肿瘤作用受到了广泛关注。研究发现，苦参素能够抑制肿瘤细胞增殖，引起细胞周期阻滞，促进细胞凋亡、抗肿瘤新生血管形成以及抑制肿瘤侵袭等［8］。也有研究发现，苦参素有放疗增敏作用［2］，但增敏机制不甚清楚。本研究实验结果亦显示苦参素能够抑制A549细胞的增殖，这一作用呈时间和剂量依赖性。

研究显示，Ku70基因高表达的肿瘤细胞对放射线耐受，而低表达则高度敏感［9］。有研究表明，抑制Ku70基因和蛋白的表达可提高肿瘤细胞放射线的敏感性，反映了Ku70的表达与细胞对放射线的敏感性密切相关。本研究发现，单纯放疗后肺癌细胞Ku70 mRNA及蛋白的相对表达水平明显增加，表明放射线在杀伤肺癌细胞的同时，也诱导了Ku70基因及蛋白的表达增加，NHEJ通路的DNA损伤修复功能被激活，以抵抗放射线对肺癌细胞的杀伤作用，也证明了Ku70在肺癌细胞对放疗的耐受中具有重要作用，其表达水平可以作为预测肿瘤对放疗敏感性的标志，这与 Komuro等［10］研究结果一致。本研究还发现，单独用苦参素处理肺癌A549细胞后Ku70 mRNA及蛋白的表达水平较对照组下降。同时苦参素联合放射线处理肺癌A549细胞后，Ku70 mRNA及蛋白的表达较单纯放射线处理明显下调，也表明了苦参素可以抑制Ku70的表达，从而影响了DNA的修复，起到了增加放射线敏感性的作用，这也可能是其放疗增敏机制之一。

综上所述，苦参素对肺癌A549细胞具有放疗增敏作用。其增敏机制可能是通过下调Ku70表达，抑制细胞DNA损伤修复功能来实现。

［1］黄赞松，周喜汉.苦参素药理和抗肿瘤作用研究［J］.医学综述，2009，15(11):1701-1704.

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［3］蒋晓东，戴鹏，吴瑾，等.重组人血管内皮抑制素通过改善乏氧增强肺腺癌放射敏感性的体外实验研究［J］.山东大学学报(医学版)，2011，49(12):5-9.

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［6］Doherty AJ，Jackson SP.DNA repair:how Ku makes ends meet［J］.Curr Biol，2001，11(22):920-924.

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［9］Qi D，Hu Y，Zhang Y，et al.Effect of Ku70 expression on radiosensitivity in renal carcinoma 786-O cells［J］.Cancer Cell Int，2014(14):44.

［10］Komuro Y，Watanabe T，Hosoi Y，et al.Prediction of tumor radiosensitivity in rectal carcinoma based on p53 and Ku70 expression［J］.J Exp Clin Cancer Res，2003，22(2):223-228.