年龄及单眼形觉剥夺对大鼠视皮层AMPA受体GluR2/3表达的影响

贾佳，赵堪兴

(1天津市第五中心医院，天津300450;2天津市眼科医院)

α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异噁唑丙酸(AMPA)受体是离子型谷氨酸受体中重要的亚型，在中枢神经系统(CNS)内主要介导快速的兴奋性突触传递，在长时程增强(LTP)、长时程抑制(LTD)和学习记忆等方面均具有重要作用［1］。研究认为，无AMPA受体表达的沉默突触激活转化为表达AMPA受体的功能性突触是LTP形成的重要机制［2，3］。AMPA受体的表达随视觉发育的不同时期而发生变化，早期异常视觉经验亦影响AMPA受体的表达，但不同的干预措施对于AMPA受体表达的影响也存在差异。本研究于2008年10月～2009年1月观察大鼠从出生后7 d到视觉发育关键期结束(45 d)视皮层Ⅱ/Ⅲ层AMPA受体GluR2/3的表达变化以及单眼形觉剥夺(MD)对大鼠视皮层GluR2/3表达的影响，探讨AMPA受体在视觉可塑性中的可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物分组及模型建立 40只健康新生(产后4～5 d)Wistar大鼠，雌雄不限，平均体质量9.4 g，均在自然光线环境下饲养。大鼠随机分为对照组25只、MD组15只。MD组大鼠于生后14 d，固定，点表麻药，剪除右眼睑缘周围毛发，碘伏消毒上下眼睑局部皮肤，距上下睑缘各1.0 mm处剪去皮肤和睑板组织，用6-0丝线间断缝合上下眼睑约3～4针。术后1周内每天涂抗生素眼膏，检查创口情况，避免感染及缝线脱落。约1周创口愈合，上下眼睑粘连，MD模型建立成功。

1.2 动物脑组织取材 实验大鼠称重后用10%的水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔注射，麻醉满意后，仰卧固定四肢，剪开胸腔将胸壁抬起，暴露心脏及升主动脉，将灌注针头由心尖部导入升主动脉，固定，在右心耳处剪一小洞，先用0.01 mol/L的PBS灌洗至溢出液变清，然后用4%多聚甲醛(1 mL/g)全身灌注固定(前2/3体积快灌、后1/3体积慢灌)。打开颅骨，切取大鼠脑组织，放入4%多聚甲醛溶液，4℃冰箱固定过夜，转移至30%蔗糖溶液中脱水，4℃至沉底，再重复脱水1次。对照组分别于生后7、14、21、28、45 d，MD组缝合右眼后继续饲养至出生后21、28、45 d，各取5只多聚甲醛全身灌注后切取脑组织固定、脱水。

1.3 视皮层GluR2/3表达检测 将脱水后的组织块根据《大鼠脑立体定位图谱》切取正常大鼠视皮质部分，OCT包埋，固定于-20℃恒冷箱，冷冻切片机切片，片厚12 μm，每只大鼠视皮层切片5张。如不能立即进行染色，切片置于-20℃冰箱中存放。采用荧光免疫组化染色法，严格按照试剂盒说明书操作，阴性对照用PBS代替一抗。采用Nikon TE2000-U倒置荧光显微镜下观察，用Olympus显微摄像系统采集图片。显微镜为200倍时将亮度调节定位于初级视皮层Ⅱ/Ⅲ层，在相同放大倍数及相同光强度条件下采集图像。用Image-proplus 6.0专业图像分析软件，记录视皮层17区Ⅱ/Ⅲ层GluR2/3的阳性细胞(手工计数)、阳性面积(area)和累积吸光度值(IOD)，计算平均吸光度(AOD)值=IOD/area。

1.4 统计学方法 采用SPSS16.0统计软件。计量资料以±s表示，比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

镜下观察可见，GluR2/3阳性反应物呈绿色荧光，在大鼠皮层组织广泛分布。视皮层17区各层可见不同密度的阳性细胞分布，Ⅰ层几乎未见明显阳性细胞，Ⅱ/Ⅲ层分布较密集，Ⅳ、Ⅴ及Ⅵ层中等密度。阳性部位主要位于细胞膜及部分胞质。两组大鼠出生后 7、14、21、28、45 d 视皮层Ⅱ/Ⅲ层内GluR2/3表达水平比较见表1。对照组大鼠视皮层Ⅱ/Ⅲ层GluR2/3阳性细胞数、AOD值14 d最小，与7 d比较差异无统计学意义(P均＞0.05)，与21、28、45 d比较差异有统计学意义(P均＜0.05)，14～45 d阳性细胞数、AOD值逐渐增加。MD组21、28、45 d阳性细胞数及AOD值呈递增趋势，但与对照组比较均明显下降(P均＜0.05)。

表1 两组大鼠不同时间视皮层Ⅱ/Ⅲ层GluR2/3表达水平比较(±s)

表1 两组大鼠不同时间视皮层Ⅱ/Ⅲ层GluR2/3表达水平比较(±s)

注:与同组14 d比较，#P＜0.05;与对照组同时点比较，*P＜0.05。

组别 n阳性细胞数(个/视野)7 d 14 d 21 d 28 d 45 d对照组 5 143.13±9.53 135.20±9.47 150.40±8.19# 154.40±10.23# 164.93±9.14#MD组 5 - - 140.13±11.06* 141.27±8.70* 145.13±8.47*组别 n 阳性细胞AOD值7 d 14 d 21 d 28 d 45 d对照组 5 0.054 5±0.010 7 0.065 5±0.011 8 0.084 8±0.011 4# 0.096 7±0.014 7# 0.105 1±0.015 2#MD组 5 - - 0.065 6±0.012 0* 0.081 3±0.011 1* 0.089 3±0.013 7*

3 讨论

Rumpel等［4］发现，大鼠生后发育早期视皮层内存在一定比例的沉默突触，但只含有功能性N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体，未检测到AMPA受体反应。随着发育，AMPA受体逐渐插入突触内，导致沉默突触转变为功能性突触。相对于NMDA受体的稳定，突触后膜上的AMPA受体的状态和数目高度可变［1］，这种动态变化对于调节突触传递效能具有十分重要的作用，而传递效能的变化是突触可塑性的主要表现，因此AMPA受体在介导突触可塑性方面具有重要作用。Gordon等［5］观察猫视皮层及海马神经元AMPA受体的表达，在生后7～42 d二者AMPA受体的表达均逐渐增高，从42 d至成熟期表达下降，但不明显。Smith等［6］研究表明，雪貂生后视皮层GluR1含量较低，在生后2周急剧增加，2～3周达最高值，然后逐渐降至成年水平。王昌鹏等［7］研究发现，GluR2阳性神经元数量在大鼠生后5周时达顶峰，随后保持稳定水平;GluR2免疫反应的AOD值也随发育逐渐增加，生后6周时达顶峰，随后保持稳定水平。王昌鹏等［8］采用脑片膜片钳全细胞记录技术记录生后3～8周正常大鼠视皮层AMPA受体介导的兴奋性突触后电流，生后3～6周AMPA受体电流的幅值随发育时间逐渐增加，6～8周幅值变化不显著。由此推测，突触后AMPA受体的功能变化可能参与了视觉发育可塑性关键期的终止过程，包含GluR2亚基的AMPA受体可能代表一种成熟的兴奋性突触后受体，在视觉发育可塑性关键期终止前插入未成熟突触内，促进突触稳定，关键期终止后到成年阶段，维持突触结构稳定并介导稳定的兴奋性突触传递。本研究发现，生后7 d至关键期结束大鼠阳性细胞数、AOD值随年龄增长呈现逐渐增高的趋势。随着年龄增长，视觉通路各级神经元及神经纤维逐渐发育，神经元间的联系逐渐增强，神经纤维对视觉刺激的反应逐渐同步，突触递质的释放逐步集中，GluR2/3的表达也逐步增加，直至视觉发育关键期末，视觉神经系统已基本发育成熟，突触联系已基本建立，并且达到一种相对稳定的状态。

AMPA受体的表达受早期视觉经验的影响，但不同的干预措施对于AMPA受体表达的影响也存在差异。Rossner等［9］观察正常幼年大鼠视皮层AMPA受体亚单位的mRNA表达，发现GluR1低于成年水平，而GluR2～GluR4均高于成年水平，单眼剥夺对GluR4无影响，而GluR1～GluR3均有不同程度下降。Kumar等［10］采用放射性自显影方法定量观察大鼠视皮层AMPA结合位点，发现其从出生至生后20 d表达增加，而单眼剥夺引起视皮层Ⅱ～Ⅵ层AMPA受体表达减少。Wrong-Riley等［11］研究证实，初级视皮层Ⅱ/Ⅲ和Ⅵ层GluR2的表达受视觉输入及神经元活性影响，单眼输入阻滞可引起剥夺眼优势柱及GluR2的下调。孙晓楠等［12］研究表明，敏感期内形觉剥夺组SD大鼠视皮层AMPAGluR2的蛋白表达及mRNA均较对照组下降。本研究观察的3个时段MD组大鼠视皮层Ⅱ/Ⅲ层内GluR2/3阳性细胞数量及AOD值较正常对照组均明显下降，与上述研究结果一致。由此可见，异常的视觉经验可以影响GluR2/3的正常表达;但形觉剥夺后(出生后21～45 d)GluR2/3的表达仍呈现递增趋势，由此推测，形觉剥夺仅能部分影响GluR2/3的表达，但并不能完全阻断GluR2/3增多的趋势。

综上所述，在视觉发育关键期内大鼠GluR2/3的表达同时受年龄及视觉经验双重因素的影响与调控。但视觉经验是通过何种途径影响AMPA受体的表达以及AMPA受体在视觉可塑性及弱视发病中的具体作用机制有待进一步研究。

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