星点设计效应面法优选白芷中欧前胡素和异欧前胡素的醇提工艺

李 靖，路莎莎

张掖市中医医院，甘肃张掖734000

星点设计效应面法优选白芷中欧前胡素和异欧前胡素的醇提工艺

李 靖，路莎莎

张掖市中医医院，甘肃张掖734000

目的：利用效应面法优选白芷的醇提取工艺参数。方法：采用HPLC方法，Waters公司的Sunf ire C18色谱柱（150 mm×4.6mm，5μm）；流动相为甲醇-水（70∶30），等度洗脱；流速0.9mL/min；检测波长254 nm；柱温30℃；分析时间为20分钟；进样量10μL。结果：白芷中欧前胡素的最佳提取工艺为甲醇浓度83.17%，提取时间9.15小时，甲醇用量为147.32mL；异欧前胡素的最佳提取工艺为甲醇浓度91.83%，提取时间9.15小时，甲醇用量为112.68mL。结论：采用星点设计与效应面法相结合的方法对实验工艺优化更方便、更准确。

白芷；欧前胡素；异欧前胡素；星点设计；效应面法

白芷始载于《神农本草经》，为伞形科植物白芷Angelica dahurica(Fisch.ex Hof fm.)Benth.et Hook.f或杭白芷Angelica dahurica(Fisch.ex Hof fm.)Benth.et Hook.f.var.formosana(Boiss.) Shan et Yuan的干燥根，因初生根杆为芷，色白，故名白芷，其性温，气芳香，味辛，微苦，具有散风除湿、通窍止痛、消肿排脓的作用，临床广泛应用于感冒头痛、眉棱骨痛、鼻塞、鼻渊、牙痛、白带、疮疡肿痛等病症，并有较好的疗效［1-2］。白芷全株含挥发油，由根挥发油中检出29种化合物，其质量控制的指标性成分为欧前胡素和异欧前胡素［3］。星点设计是在二水平析因设计的基础上加上星点(star point)及中心点(cent ral point)而成的实验次数较少，适宜进行非线性拟合的实验设计法，具有实验设计简单，试验次数少，精密度高的特点［4-6］，笔者使用星点设计法三维效应面法对白芷中欧前胡素和异欧前胡素的提取工艺进行筛选，优选出最佳的方法，为白芷中有效成分提取分离工艺研究提供可靠的实验依据。

1 药材与试剂、仪器

1.1 药材 经甘肃中医学院杨福德教授鉴定为杭白芷Angelica dahurica(Fisch.ex Hof fm.) Benth.et Hook.f.var.form osana(Boiss.)Shan et Yuan的干燥根，均为正品药材。

1.2 试剂 欧前胡素(北京中西远大科技有限公司提供，纯度大于99.9%，批号：DQ201010)，异欧前胡素(北京中西远大科技有限公司提供，纯度大于99.9%，批号：YD201012)，甲醇(天津市红岩化学试剂厂提供)，乙腈色谱纯(成都金山化学试剂有限公司提供)，哇哈哈纯净水等。

1.3 仪器 高效液相色谱仪(Waters600、四元泵、在线脱气系统、手动进样系统、Waters2487型紫外-可见检测器、Empower色谱工作站)；超声波清洗器(KQ2200DB，40 kHz，80W，上海新苗医疗器械制造有限公司提供)；BS201型电子天平(北京赛多利斯天平有限公司提供)；回流装置。

1.4 色谱条件色谱柱：Waters公司的Sunf ire C18色谱柱(150mm×4.6mm，5μm)；流动相为甲醇-水(70∶30)，等度洗脱；流速0.9mL/min；检测波长254 nm；柱温30℃；分析时间为20分钟；进样量10μL；欧前胡素的保留时间为(9.489±0.007)分钟；异欧前胡素的保留时间(14.767±0.012)分钟；各样品色谱图中，分离度均大于1.5；理论塔板数大于3 000；拖尾因子在0.95～1.05之间。

1.5 溶液制备

1.5.1 对照品溶液 精密称取异欧前胡素对照品1.80mg，加甲醇50mL制成浓度为0.036mg/mL的对照品溶液；精密称取欧前胡素对照品1.75mg，加甲醇50mL制成浓度为0.035mg/mL的对照品溶液。

1.5.2 供试品溶液 参照《中国药典》白芷含量测定项下供试品溶液的制备方法［7］。称取5 g份的白芷样品20份按照据星点设计方案，甲醇浓度、提取时间、加入甲醇量3个自变量的水平极值分别为：X1(甲醇浓度)：80%～95%；X2(提取时间)6～10小时；X3(甲醇用量)100～160mL配制待用。

2 方法学考察

2.1 线性关系考察 精密吸取对照品异欧前胡素溶液0.5、1.0、2.5、3.0、4.0、5.0mL置于10mL的容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，进样20μL，以对照品浓度对峰面积积分分值线性回归得异欧前胡素的回归方程为：Y=6.6×107X-1.761 9×104，相关系数r=0.999 2。精密吸取对照品欧前胡素溶液0.4、0.6、2.0、3.0、5.0mL置于5mL的容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，进样20μL，以对照品浓度对峰面积积分分值线性回归得欧前胡素的回归方程为：Y=6.2×107X-1.07×104相关系数r=0. 999 1。结果表明异欧前胡素和欧前胡素的含量分别在0.001 8～0.018 mg/mL和0.002 8～0.035mg/mL范围内线性关系良好。

2.2 精密度实验 精密吸取同一浓度的对照品溶液，连续进样5次，得到异欧前胡素和欧前胡素峰面积，计算异欧前胡素峰面积的RSD为0.37% (n=5)，欧前胡素的峰面积的RSD为0.30%(n=5)，表明本方法精密度良好。

2.3 重复性实验 取白芷，按供试品制备方法制备5份样品溶液，得到异欧前胡素和欧前胡素峰面积，计算欧前胡素峰面积的RSD为1.46% (n=5)，异欧前胡素峰面积RSD为1.51%(n=5)。

2.4 稳定性实验 取白芷的供试品溶液，分别在0、2、6、8、12小时进样测定，计算欧前胡素峰面积的RSD为0.99%(n=5)，异欧前胡素的峰面积的RSD为2.39%(n=5)，结果表明样品在12小时内稳定。

2.5 回收率实验 精密称取同一已知含量的样品6份，分别精密加入一定量的对照品，制得样品溶液后，依法进样测定，结果欧前胡素的回收率为97.6%，RSD为1.7%，异欧前胡素的回收率为98.8%，RSD为1.5%。

3 星点设计效应面法优选白芷提取工艺

3.1 实验设计 选择对甲醇提工艺影响较大的因素，即醇提浓度、提取时间、甲醇用量3个主要因素。水平安排遵循任意两个物理量之间的差值与对应代码之间差值成等比的原则。采用星点设计方法进行多元线性回归和二项式拟合，用效应面法优化工艺条件，并进行预测分析。如以X2为例，代码1所对应的物理量N的求算：(N-6)/ (10-6)=[1-(-1.732)]/[1.732-(-1.732)]，N=[1-(-1.732)]/[1.732-(-1.732)]×(24-6)+6=9.2。3个因素的取值见下表，以欧前胡素和异欧前胡素提取率、相对总峰面积做为评价指标来优选醇提工艺，因素水平见表1。

表1 甲醇提工艺3个考察因素的代码水平及对应物理量

3.2 星点设计及结果 取白芷药材50 g，按照表1中实验安排进行提取，HPLC测定溶液中欧前胡素和异欧前胡素含量，并计算其提取率。实验设计表及供试品重叠色谱图见图1、表2。

图1 重叠色谱图

表2 星点设计及其结果

4 数据处理

4.1 模型拟合 以样品白芷中欧前胡素和异欧前胡素提取率为因变量，对各因素进行多元线性回归和二次多项式拟合。多元线性回归拟合模型为：Y=b0+b1X1+b2X2+b3X3。

实际方程为：Y1=+0.143 65+1.173 87E-003X1+0.033 053 X2-1.11301E-003X3(相关系数R=0.089，F=4.00，Df=16，P=0.066 8，调整后的相关系数Ra=0.080)。由模型方程参数F=4.00，Df= (5，11)，P值=0.066 8＞0.05，可以看出，方程的拟合度不佳，预测性较差。

Y2=0.059 096+7.664 54E-004X1+ 2.09016E-003X2-6.46398E-004X3(相关系数R=3.638E-003，F=0.53，Df= (11，16)，P=0.8249，调整后的相关系数Ra=1.954E-003)。由模型方程参数F=4.00，Df=16，P=0.8249＞0.05，可以看出，方程的拟合度不佳，预测性较差。

二次多项式回归拟合模型为：Y=b0+b1X1+b2X2+b3X3+b4X12+b5X22+b6X32+b7X1X2+b8X2X3+b9X1X3

实际方程为：Y1=0.58411-0.053396X1+0.26635X2+0.014 489X3-3.17345E-003X1X2-37583E-004X1X3+ 1.52336E-003X2X3+6.92817E-004X12-9.60387E-003X22(相关系数R=0.96，调整后相关系数Ra=0.98，F=5.54，Df=(6，11)，P=0.0114)二次多项式相关系数R=0.96，P=0.0114＜0.05，与线性拟合相比有较大提高，说明该方程有较高的可信度。

Y2=-3.62350E-003X1-0.019468X2-4.67639E-003X3+7.21110E-004X1X2-4.02828E-005X1X3+1.71972E-004X2X3+ 2.17933E-005X12-3.99679E-003X22-1.22226E-005X32(相关系数R=0.94，调整后相关系数Ra=0.95，F=14.38，Df=(6，11)，P=0.0051)二次多项式复相关系数R=0.94，P=0.0051＜0.05，与线性拟合相比有较大提高，说明该方程有较高的可信度。

4.2 工艺优化 根据二次多项式方程，绘制各考察指标与另外两个试验因素的三维反应曲面关系图，以欧前胡素为例，结果见图2—4。

图2 欧前胡素(Y1)提取率对甲醇浓度和提取时间的三维效应面图

图3 欧前胡素(Y1)提取率对甲醇浓度和甲醇用量的三维效应面图

图4 欧前胡素(Y1)提取率对提取时间 和甲醇用量的三维效应面图

4.3 工艺验证 为验证所建立的数学模型，分别针对欧前胡素和异欧前胡素各选择3组不同条件的平行试验，得到的实测值与数学模型得到的预测值进行比较，验证预测值与实际值偏差较小显示方程预测性很好，结果见表3。

表3 工艺验证

5 结果与讨论

星点设计是二元多因素五水平的实验设计［8-12］。常常被用来对工艺参数进行优化。它是目前国外使用较广泛的一种优化设计方法，该实验是由2次的因子实验、2次的轴实验和计算出的中点实验组成［13-16］。根据实际情况，由实验结果图直接选取最大提取率各因素最佳取值：欧前胡素的最佳提取工艺为甲醇浓度83.17%，提取时间为9.15小时，甲醇用量为147.32mL；异欧前胡素的最佳提取工艺为甲醇浓度91.83%，提取时间为9.15小时，甲醇用量为112.68mL。

［1］ 贾敏如，马逾英.川芎、川白芷生产质量管理规范(GAP)的研究［M］.成都：四川科学技术出版社，2007：96-98.

［2］刘景云.浅谈白芷的种植技术［J］.甘肃中医，1988，2(1)：46-47.

［3］ 周继铭，杭宜卿，余朝菁.白芷的研究——化学成分的研究［J］.中草药，1987，18(6)：2.

［4］ 蒋荣珍，欧阳小光，黄斌，等.星点设计-效应面法优选黄芩提取工艺的研究［J］.中国中医药信息杂志，2009，16(增刊)：33-34．

［5］Friedman JH.Mul tivariate adaptive regression spl ines with discussion［J］.The Annals of Statistics，1991，19(1)：1-11.

［6］Kleijnen JPC，Hertog D，Angun E，et al.Response surface method-ology's steepest ascent and stepsize revisited Crrection［J］.European Journal of Operational Research，2006，17(1)：664-666.

［7］ 国家药典委员会.中国药典：一部［M］.北京：中国医药科技出版社，2010：446-447.

［8］ 彭小霞，路莎莎.星点设计响应面优化法在中药研究中的应用和发展［J］.中国实验方剂学，2011，17(19)：297-299.

［9］ 高凯，钟昌茂，邝少轶.星点设计-效应面法优化复方氯雷伪麻缓释片的缓释片芯处方［J］.中国药房，2014，25(37): 3499-3501.

［10］谢华阁，谢辉，张兴德，等.星点设计-效应面法优选保肝降脂浸膏水提工艺［J］.中国药房，2014，25(35):3285-3288.

［11］满尔哈巴·海如拉，薛桂蓬，杨伟俊，等.星点设计-响应面法优化维吾尔药刺山柑果总酚酸提取工艺［J］.中国实验方剂学杂志，2014，20(18):30-33.

［12］朱志红，曲绪楷，梁静阁，等.基于星点设计-效应面法优化的曲美他嗪双层渗透泵控释片的制备及评价［J］.中国新药与临床杂志，2014，33(8):599-603.

［13］张冕.星点设计-效应面法优化盐酸川芎嗪眼用温度敏感型原位凝胶的处方［J］.山东化工，2014，43(7):15-18.

［14］李天庆.“生肌玉红膏”制备工艺及影响质量的因素探讨［J］.西部中医药，2012，25(6)：26.

［15］郭伟良，由鹏飞，房晶，等.响应面法优化连翘苷超声提取工艺［J］.中国医药工业杂志，2009，40(12)：919-920.

［16］刘泽峰，何屹.响应面法优化中药片剂薄膜包衣工艺研究［J］.中医药导报，2009，15(12)：67-68.

AlcoholExtraction of Im peratorin and Isoim peratorin from Selected Baizhiby CCD and RSM

LIJing,LU Shasha
Zhangye Hospital of Chinese Medicine,Zhangye 734000,China

Objective:To collect the extracting parameters of the alcohol from Baizhi(angelica dahurica)by central composite design(CCD)and response surfacemethod(RSM).Methods:The HPLCmethod was performed and the detected conditionswere defined,chromatography column:Waters'Sunfire C18(150mm×4.6mm,5μm); mobile phase:CHOH/H2O=70/30,isocratic elution;flow rate:0.9m L/m in;detection wavelength:254 nm;column temperature:30℃;analyzing time:20min;injection volume:10μL.Results:The bestconcentration ofmethanol for extracting the imperatorin from Baizhi was83.17%,the extracting timewas9.15 hoursand themethanoldosagewas 147.32m L，while forextracting the isoimperatorin the bestconcentration ofmethanolwas91.83%w ith 9.15 extracting hours and 112.68 m Lmethanol dosages.Conclusion:Themethod of combining CCD and RSM is easier and more accurate foroptim izing the extracting process.

Baizhi;imperatorin;isoimperatorin;CCD;RSM

R259

A

1004-6852(2015)02-0023-04

2014-07-10

李靖(1979—)，男，主管药师。研究方向：中药提取。