高强度间歇运动对骨骼肌糖原含量的影响及机制研究

施曼莉，朱 荣

运动过程中，葡萄糖是骨骼肌最重要的能源物质之一，肌糖原则是葡萄糖的储存库，运动时肌糖原分解产生大量ATP以供肌肉活动利用，运动后的恢复过程主要是肌糖原的再合成，因此，肌糖原的储备与再合成的速率是影响运动能力与训练效果的重要因素［18］。近年来，在传统有氧运动方式（持续有氧运动）基础上，发展了一种新颖的运动模式，即高强度间歇运动（high intensity interval training，以下简称“HIIT”）。实验证实，HIIT是一种有效率的训练方式，只需较少的运动时间即可达到与低强度长时间运动消耗同等的能量，已在竞技体育和大众健身中得到广泛应用［2］。研究发现，长期中低强度持续有氧运动可增加肌糖原含量［15］，但 HIIT与肌糖原的关系及机制鲜有关注。本研究旨在观察8周HIIT对SD大鼠骨骼肌糖原含量的影响并探讨其可能机制，为竞技训练和大众健身运动处方的科学制定提供依据。

1 研究对象与方法

1.1 实验动物

健康雄性SD大鼠20只，6月龄，体质量250～300g，由军事医学科学院实验动物中心提供［动物生产许可证批号：SCXK—（军）2007—004，动物批号：0006645，动物使用许可证批号：SYXK（京）2008—0009］，自由进食水。本实验在北京体育大学科研中心和中国农业科学院生物技术研究所作物功能基因与遗传改良研究室完成。

1.2 动物分组与训练方案

将动物随机分为对照组（control group，CG）和 HIIT组（high intensity interval training group，TG），CG大鼠在鼠笼内自由活动，TG大鼠进行为期8周的高强度间歇训练，训练方案如下：先以速度为8.3m／min进行4min准备活动，之后以10°、25m／min、4min和0°、8.3m／min、4min交替进行（根据Bedford等［6］的研究结果，运动强度分别为90%˙VO2max和60% ˙VO2max），重 复 7 组，60min／d，5d／周。实验动物在正式训练前先进行2d跑台适应，坡度0°，速度8.3m／min。

1.3 一般情况观察

观察大鼠的体毛色泽、精神状态、大便形态及活动情况等外在表现。每日上午训练前，用电子秤（感量为1g）称量各组大鼠体重（g）。每日定时定量给予各组大鼠相同量饲料，次日称量剩余饲料，计算摄食量（g）。

1.4 力竭时间测定

各组大鼠在末次训练后第二天进行一次递增负荷运动实验，方案：进行10min跑台热身运动（速度5m／min）后，起始负荷设定为10m／min，每3min递增5m／min，直到力竭。力竭判定标准：动物跟不上预定速度，大鼠臀部压在笼具后壁，后肢随转动皮带后拖达30s，毛刷刺激驱赶无效；行为特征为呼吸深急、幅度大，精神疲倦，俯卧位垂头，刺激后无反应。记录力竭时间。

1.5 动物取材

2组动物在末次运动后48h称重，心脏取血并断头处死，全血离心（4℃、3 000r／min）后取血清。迅速分离股四头肌用锡纸包裹投入液氮中并转移至－80℃低温冰箱冻存待测。

1.6 血糖和血胰岛素测定

氧化酶法测定血糖浓度，试剂盒购自南京建成生物有限公司，检测仪器为MD－100半自动生化分析仪（单位：mg／dL）。放免法测定血清胰岛素含量，试剂盒购自武汉博士德生物公司，检测仪器为FMQ－9013C型γ放免仪（单位：ng／mL）。严格按照操作说明书进行。

1.7 肌糖原含量测定

采用蒽酮法测定，方法：取50mg骨骼肌加3倍体积浓碱溶液，沸水浴20min，冷却后用双蒸水稀释20倍配成溶液。取100μL溶液加水至1mL，加入2mL蒽酮显色剂，震荡混匀，沸水浴5min，冷却后以空白管调零，测定各样品和葡萄糖标准溶液在620nm处的吸光度，计算糖原含量（单位：nmol／mg）。测试仪器：722型光栅分光光度计。

1.8 葡萄糖摄取率测定

取100mg骨骼肌，分别加入到不含胰岛素（－ins）或含胰岛素（＋ins）的 Krebs－Ringer碳酸盐缓冲液中（1.0 μmol／L）。在室温（37℃）、95%O2、5%CO2条件下震荡孵育1h，加入1.5nmol／L 2－脱氧葡萄糖（2－DG）和0.5μ Ci3H－2－脱氧葡萄糖（3H－2－DG），继续孵育30min。洗涤肌肉组织后转移至液闪瓶中，加入过氯酸和双氧水，80℃消化3～4h，室温冷却。加乙二醇乙醚和闪烁液，暗室放置12h。用全自动液闪仪（Beckman LS 3801，美国）测定其放射性（单位：pmol／mg／min）。

1.9 糖原磷酸化酶（glycogen phosphorylase，GP）活性测定

取50mg骨骼肌，置于0.5mL预冷的蛋白酶提取缓冲液中充分匀浆，离心（4℃、14 000g）30min取上清。取50μL上清液加等体积含2.5mCi／mol［14C］－G－1－P（葡萄糖－1－磷酸）的酶测定缓冲液，活化型GP（有活性的GP）测定介质不含AMP（－AMP），GP总酶测定介质含6mmol／L AMP（＋AMP）。用液体闪烁计数仪（Beckman LS 3801，美国）测定14C掺入糖原的放射活性（单位：nmol／mg／min）。GP活性用活化型酶活性与总酶活性的比值表示（－AMP／＋AMP），即活性GP比值。

1.10 糖原合酶（glycogen synthase，GS）活性测定

取50mg骨骼肌匀浆后加入0.5mL GS提取液中，离心（4℃、14 000g）30min，取上清。取50μL上清液加入等体积含0.1mCi／mmol［14C］－UDPG（尿苷二磷酸葡萄糖）的酶测定缓冲液，活化型GS（有活性的GS）测定的介质不含 G－6－P（葡萄糖－6－磷酸）（－G6P），GS总酶测定的介质含10mmol／L G－6－P（＋G6P）。用液体闪烁计数仪（Beckman LS 3801，美国）测定14C掺入糖原的放射性活性（单位：pmol／mg／min）。GS活性用活化型酶活性与总酶活性的比值表示（－G6P／＋G6P），即活性GS比值。

1.11 骨骼肌细胞膜分离

取100mg骨骼肌冰上剪碎，加入裂解液［Tris－HCL（pH 7.5）20mol／L，蔗 糖 330mol／L，EDTA 0.5mol／L，PMSF 1mol／L，Lepeptin 25mg／L］，冰浴中匀浆，4℃1 000 r／min离心10min。取上清以40 000r／min离心1h，弃上清，在沉淀中再加入前述裂解液，用超声裂解的方法循环萃取7次，再以40 000r／min离心1h，得到的上清液即为骨骼肌细胞膜组织。迅速转移至－80℃低温冰箱冻存待测。

1.12 Western Blotting测定蛋白表达量

取100mg骨骼肌匀浆裂解后，离心（4℃、15 000g）20 min，用考马斯亮蓝法测定总蛋白浓度。取10μg蛋白样品在垂直电泳仪（BIO－RAD，美国）上经15%SDS－PAGE分离后转移至PVDF膜上。兔抗鼠葡萄糖转运体4（glucose transporter type 4，GLUT4，包 括 总 GLUT4和 肌 膜GLUT4）、GP及磷酸化 GP（p－GP）、GS及 磷酸化 GS（p－GS）、4℃静置孵育过夜，洗涤3次。再以1∶1 000辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG抗体室温孵育1h，充分洗涤后，使用ECL试剂盒发光显影，X线胶片压片曝光，扫描定量各条带的相对灰度值，β－actin为内参蛋白。

1.13 统计学处理

所有数据以“平均数±标准差”表示。组间比较独立样本t检验，对糖原含量和力竭时间进行简单相关分析并计算Pearson相关系数（r）。统计学差异定为P＜0.05。统计软件为SPSS 15.0。

2 结果

2.1 实验期间CG和TG组大鼠的一般情况

整个实验期间2组大鼠精神状态均未出现明显异常，所有大鼠未发现掉毛、体毛凌乱、无光泽、大便形态改变等不良反应。摄食量在2组间无显著性差异（P＞0.05，图1）；TG大鼠体重在第6～8周低于CG（P＜0.05，图2）。

图1 本研究CG和TG组摄食量的变化示意图Figure 1. Changes of Food Consumption

图2 本研究CG和TG组体重的变化示意图Figure 2. Changes of Body Weight

2.2 CG和TG组力竭时间比较

8周运动后，TG大鼠力竭时间较CG大鼠提高了41.3%（P＜0.05，表1）。

表1 本研究CG和TG组力竭时间比较一览表Table 1 Comparison of Exhaust Duration between Two Groups

2.3 CG和TG组血糖、胰岛素和肌糖原含量的变化

血糖和血胰岛素在2组间均无显著性差异（P＞0.05）。TG肌糖原含量高于CG（P＜0.05，表2）。

表2 本研究CG和TG组血糖和血胰岛素浓度的变化一览表Table 2 Changes of Blood Glucose and Serum Insulin

2.4 肌糖原含量与力竭时间的相关分析

相关分析显示，肌糖原含量与力竭时间显著正相关（CG：r＝0.68，P＜0.05；TG：r＝0.75，P＜0.05）。

2.5 CG和TG组葡萄糖摄取率和GLUT4蛋白表达的变化

8周后，基础葡萄糖摄取率（－ins）在TG和CG间无显著性差异（P＞0.05），但胰岛素介导的葡萄糖摄取率（＋ins）TG高于CG（P＜0.05，表3）。TG总 GLUT4和肌膜 GLUT4均显著高于CG（P＜0.05，图4）。

表3 本研究CG和TG组葡萄糖摄取率的变化一览表Table 3 Changes of Glucose Uptake Rate

图4 本研究CG和TG组总GLUT4和肌膜GLUT4蛋白的变化示意图

2.6 GP活性和蛋白表达的变化

2组活化型GP活性（－AMP）、GP总酶活性（＋AMP）、活性GP比值（－AMP／＋AMP），GP和p－GP蛋白表达量以及p－GP蛋白／GP蛋白比值均无显著性差异（P＞0.05，表4，图5）。

表4 本研究CG和TG组GP活性的变化一览表Table 4 Changes of GP Activity

2.7 GS活性和蛋白表达的变化

活化型GS活性（－G6P）在两组间无显著性差异（P＞0.05），GS总酶活性（＋G6P）TG高于 CG（P＜0.05），而活性GS比值（－G6P／＋G6P）TG低于CG（P＜0.05，表5）。GS蛋白和p－GS蛋白表达量TG高于CG（P＜0.05），而p－GS蛋白／GS蛋白比值在两组间无显著性差异（P＞0.05，图6）。

图5 本研究CG和TG组GP和p－GP蛋白的变化示意图Figure 5. Changes of GP and p－GP Protein Expression

表5 本研究CG和TG组GS活性的变化一览表Table 5 Changes of GS Activity

图6 本研究CG和TG组GS和p－GS蛋白的变化示意图Figure 6. Changes of GS and p－GS Protein Expression

3 讨论

近年来，在传统持续有氧运动基础上，发展了一种新颖的提高有氧能力的运动模式——HIIT，研究表明，HIIT只需较少的运动时间即可达到与低强度、长时间运动消耗同等的能量，且由于运动时间较短、存在间歇，更容易被接受［2］。HIIT已在竞技体育和大众健身中广泛应用，其安全性也得到了大样本实验和Meta－分析的证实［23］，但HIIT对肌糖原含量的影响及机制鲜有关注。

3.1 HIIT通过上调骨骼肌糖原含量提高运动耐力

有实验证据表明，肌糖原耗竭是导致疲劳的主要原因，提高肌糖原水平则可延缓运动中疲劳的发生并改善机体的运动能力［17］。运动对肌糖原含量的影响与运动负荷有关，大强度离心运动后24～72h肌糖原恢复受损［10］，马拉松比赛后肌糖原含量至第7天尚未完全恢复［4］，提示大强度、长时间运动可能会延长肌糖原恢复时间，即Snyder等［20］提出的过度训练的糖原耗竭学说。一般认为，耐力训练可提高肌糖原含量，而2周持续有氧运动后1h和6h糖原含量未见显著性差异，可能与取材时间过早以及未及时补充碳水化合物有关［3］，若运动后持续补充碳水化合物，肌糖原含量则在运动后4～6h明显升高［16］。

本研究建立HIIT模型，发现8周实验期间TG大鼠在活动情况、精神状态、毛色以及大便形态等方面无明显异常，说明本实验采用的运动负荷和训练方案适宜，并未造成过度训练。取材时间是在末次运动后48h，因此避免了急性运动的应激效应，结果发现，TG大鼠骨骼肌糖原含量明显高于CG大鼠，表明运动后正常饮食而不额外补充碳水化合物的情况下，经过长期HIIT亦能产生使运动后肌糖原超量恢复程度显著增加的适应性变化，同时，TG大鼠力竭时间增加，且与糖原含量显著正相关，提示HIIT可通过上调骨骼肌糖原含量进而提高运动能力。肌糖原影响运动能力的可能机制包括：1）糖原在肌纤维内分隔存在，当运动肌糖原耗尽时无法从非运动肌得到补充；充足的肌糖原则可为肌肉收缩提供更多的燃料。2）在完成相同负荷运动时，肌糖原含量低者肌肉要较多的吸收血糖供能，可引起低血糖并影响中枢神经系统的能量供应，造成疲劳过早发生；而充足的肌糖原则节省血糖利用，推迟运动性疲劳的出现。3）肌糖原是脂肪氧化供能的代谢引物，肌糖原储量不足时脂肪酸β－氧化受阻并产生酮体，体液酸化使运动能力下降；长期HIIT上调肌糖原后可提高肌细胞利用脂肪酸和血糖的能力，运动中表现出糖原节省化，维持机体长时间抗疲劳的能力。

3.2 HIIT提高骨骼肌糖原含量的可能机制

HIIT上调骨骼肌糖原含量的具体机制尚不明确。由于糖原含量受葡萄糖转运、糖原合成以及糖原分解等影响，因此研究者对上述因素进行了深入分析。GP是糖原分解的关键酶［7］。本研究发现，2组GP活性和蛋白表达量均无显著性差异，而训练后TG大鼠肌糖原含量增加，提示长期HIIT诱导的骨骼肌糖原含量增加是糖原合成增多而非糖原分解减少造成的。

肌糖原的合成与肌细胞摄取葡萄糖的速率成正比［11］。肌细胞摄取葡萄糖需GLUT作为载体，其中，GLUT4是骨骼肌葡萄糖跨膜转运的主要载体，葡萄糖转运被认为是肌细胞葡萄糖代谢的限速步骤［21］。安静时，GLUT4主要存在于 胞 浆 内，当 受 到 胰 岛 素［9］或 肌 肉 收 缩［19］刺 激 时，GLUT4向胞膜转位。在本研究中，TG大鼠总GLUT4和肌膜GLUT4蛋白量均显著性增加，提示长期HIIT可通过调节GLUT4向肌膜转位并增加其蛋白表达而促进葡萄糖摄取，其机制可能与运动激活细胞内的能量开关分子——AMP活化 蛋 白 激 酶 （adenosine monophosphate－activated protein kinase，AMPK）［1］，后 者 进 而 促 进 GLUT4 转 位 有 关。为探讨胰岛素介导的葡萄糖摄取的变化，本研究用3H－2－DG进行放射测定发现，2组血糖、血清胰岛素和基础葡萄糖摄取率（－ins）无显著性差异，而TG动物胰岛素刺激的葡萄糖摄取率（＋ins）则显著升高，说明长期HIIT提高了胰岛素敏感性。总之，GLUT4向肌膜转位有利于提高肌细胞葡萄糖转运能力，促进训练后肌糖原的超量恢复，为HIIT提高运动机能提供了重要依据。

GS是糖原合成的关键酶［7］。糖原合成时，G－6－P经过酶促反应生成糖原前体——尿苷二磷酸葡萄糖（uridine diphosphoglucose，UDPG），随后GS催化UDPG分子中的葡萄糖基转移到糖原分子的多糖链上，这一反应被认为是糖原合成的限速步骤［7］。GS可被多种蛋白激酶（如Akt）磷酸化而失活，又可在磷酸酶（如糖原合酶激酶3）作用下脱磷酸而变成活化型［5］，还能受G－6－P的别构调节使无活性的GS被激活［22］。因此，GS活性受共价修饰调节和变构调节的双重调控，GS活性通常以活化型GS活性占GS总酶活性的百分比表示。在本研究中，TG大鼠肌糖原含量显著性升高，同时伴随GS总酶活性增加以及蛋白表达量上调，提示GS总酶活性增加与蛋白表达量升高有关。研究证实，GS与糖原颗粒形成密切相关，因此推测，GS蛋白水平增加可能与糖原含量升高后酶蛋白的稳定性加强有关［14］。此外，由于TG大鼠活化型GS活性（－G6P）无显著改变，而GS总酶活性（＋G6P）、GS蛋白以及p－GS水平升高，因此，活性GS比值（－G6P／＋G6P）下降。

运动中以及运动间歇期，骨骼肌摄取葡萄糖增加，从而使 G－6－P含量增多，后者作为变构效应剂激活 GS［13］。此外，运动时糖原逐渐消耗殆尽，GS活性则显著增加。本研究取材时间点是在末次运动后48h，此时糖原储备量已经恢复，GS活性下降，因此，p－GS蛋白水平升高，而p－GP蛋白／GP蛋白比值未发生改变。将突变型肌肉GS基因敲入小鼠体内的模型中（GS不能被G－6－P变构激活，但可通过去磷酸化共价修饰而活化），结果发现，胰岛素诱导的肌糖原合成速率减少了80%，糖原含量显著下降，说明胰岛素调控肌糖原合成主要是通过对GS的变构激活实现的［8］。用5－氨 基 咪 唑－4－氨 甲 酰 核 苷 酸 （AICAR）激 活AMPK后同样发现，G－6－P对GS的变构激活是肌糖原合成的主要调节机制［12］。虽然目前尚未建立转基因动物的运动干预模型，但结合本研究中GS活性和蛋白表达以及糖原含量的变化可以推测，G－6－P对GS的变构调节（而非共价修饰调节）是HIIT诱导肌糖原合成的重要分子机制。

4 结论

长期HIIT可上调骨骼肌糖原含量并提高运动能力；HIIT诱导的糖原含量增加是糖原合成增多而非糖原分解减少造成的，其机制可能与GLUT4表达上调与转位使葡萄糖转运增加，GS表达上调以及葡萄糖－6－磷酸对GS的变构激活有关。

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