红细胞渗透脆性试验结果判断改良方法介绍

高丽 张丽霞 张杰

红细胞渗透脆性试验(OFT)可以评价红细胞在低渗氯化钠溶液中的耐受能力，是检测患者红细胞膜是否有缺陷的经典方法。该方法简便易操作，可作为临床某些溶血性疾病，如遗传性球形红细胞增多症、自身免疫性溶血性贫血和遗传性椭圆形细胞增多症等的初筛诊断［1］。

OFT为手工测定方法，判定其结果的溶血情况多采用目测观察，检测人员的主观判断和不同工作经验人员的判读都会导致人为因素的偏差，结果可能会影响临床的诊断。另一方面，目测法仅能观察到溶血的大致情况，不能量化评判红细胞破裂的程度，缺乏客观的依据。

本试验采用分光光度法测定红细胞在低渗氯化钠溶液中的溶血情况，制定红细胞渗透脆性溶血曲线，量化了溶血程度，改良了OFT的结果判断方法，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 收集20例健康对照者肝素锂抗凝静脉血5 ml，年龄28～56岁，平均(42±8.17)岁，男女各10例;8例缺铁性贫血患者肝素锂抗凝静脉血5 ml，年龄22～58岁，平均(40.75±12.36)岁，男女各4例;8例球形红细胞增多患者肝素锂抗凝静脉血5 ml，年龄26～60岁，平均(42.25±12.42)岁，男女各4例。实验室自配0.17 mol/L氯化钠(NaCl)溶液，721分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)。

1.2 方法 参照第3版操作规程将0.17 mol/L NaCl溶液对半稀释为0.085 mol/L标准品，与蒸馏水按比例配成12管不同浓度 NaCl溶液［2］，见表1。用滴管吸取肝素抗凝血，每管内滴加1滴全血，以旋转法轻轻混匀。12支小试管加完样后，500 r/min离心10 min，小心取出试管，轻轻吸取上层液体，置721分光光度计，读取 A540nm吸光度值［3］。以12号试管为100%溶血对照管，按照公式:溶血率(%)=待测管A540nm/溶血对照管A540nm×100%，计算出其余11管的不同溶血率。正常对照和待测患者的样本均按上述步骤进行检测，并分别计算出溶血率。

2 结果

2.1 正常对照组溶血率参考区域的建立 20例健康对照组，按操作步骤，每管NaCl浓度下可得20个溶血率。汇总后统计出每管浓度下的5%和95%分位数的溶血率值，建立并绘制出正常对照溶血率参考区域(图1)，灰色区域即为正常参考值区域，分布形态类似倒S型，有2个溶血率缓慢变化区段(0.28%～0.36%和0.44% ～0.50%)和1个急速变化区段(0.36% ～0.44%)。

2.2 室内质控溶血率曲线 每批检测内再以当日选定的健康对照组作为室内质控，按操作步骤，计算出每管溶血率，绘制室内质控曲线(图2)，健康对照者的溶血率曲线分布在正常参考区域内(图中灰色区域)。

表1 不同浓度梯度的NaCl溶液

2.3 待测样本的溶血率曲线 缺铁性贫血和球形红细胞增多症患者的样本，以正常对照12号试管为100%溶血管对照，计算相应待测样本的溶血率，绘制出待测患者溶血率曲线(图2)，图2中所示1例缺铁性贫血患者的溶血率曲线分布在正常参考区域下方，1例球形红细胞增多患者的溶血率曲线分布在正常参考区域上方。

图1 正常对照溶血率参考区域

图2 缺铁性贫血、球形红细胞增多症及室内质控溶血率曲线

2.4 结果判断

2.4.1 室内质控溶血率曲线分布于正常对照溶血率参考区域内，则本次试验结果可信。

2.4.2 患者红细胞渗透脆性溶血率曲线分布于正常对照溶血率参考区域内，则判定为红细胞渗透脆性正常;分布于正常对照溶血率参考区域下方，则判定为红细胞渗透脆性减低;分布于正常对照溶血率参考区域上方，则判定为红细胞渗透脆性增加。

2.4.3 缺铁性贫血的患者溶血率曲线分布于正常对照溶血率参考区域下方，红细胞渗透脆性减低;球形红细胞增多患者溶血率曲线分布于正常对照溶血率参考区域上方，红细胞渗透脆性增加。

3 讨论

3.1 传统试验的不足 OFT是衡量红细胞膜对低渗盐溶液抵抗力大小的经典试验，可用于有效筛查遗传性球形红细胞增多症及地中海贫血等疾病。正常红细胞在一定浓度的低渗盐溶液中，会发生破裂而释放出血红蛋白，经过一定时间的静置后，溶血现象就能在上清液被观察到。因此，目测法是目前唯一结果判定方法。然而，从目测法判定完全溶血、不完全溶血和不溶血3种状态，人员间比对相差较大，主观性较强，需要长期试验经验的积累，试验的有效性和可控性不理想。

3.2 改良溶血率曲线的可行性 传统OFT结果判读时，目测待测样本的开始溶血管和完全溶血管的NaCl浓度，再通过与正常对照样本的比较，若浓度相差达0.04%，则再推断患者的红细胞渗透脆性是否增加或降低。利用溶血率曲线法配合正常参考区域，对缺铁性贫血和球形红细胞增多患者样本的检验结果，与其临床诊断相符，也与传统试验方法相一致，因此验证了该方法的可行性。通过待测样本红细胞渗透脆性溶血率曲线与正常对照溶血率参考区间范围的位置关系，判定红细胞渗透脆性的情况。红细胞膜的脆性减低，则溶血率相对于对照就会降低，溶血率曲线就会整体下移，即会位于正常对照溶血率参考区域的下方;反之，则为红细胞膜的脆性增高的情况。量化的溶血判断，加上正常对照参考区域，使得OFT脱离了主观目测法，客观判定待测样本的红细胞渗透脆性，为该方法的临床应用提供了可靠的依据。

3.3 改良溶血率曲线法的优点 利用分光光度法的改进实验已有报道［4］，但仅限于实验教学，尚无临床应用。另有报道也提出了溶血指数的概念［5］，但未对结果分析而且较为复杂。本文根据吸光度值计算出溶血率，再基于多次平行实验，采用95%可信区间的统计分析方法，构建了正常对照溶血率参考区域，使得溶血结果的判断有数可依，有据可循。正常参考区域的确立，使得待测样本的结果判定更直观。同时，基于实验室自建的参考区域，在批内以正常对照样本作为室内质控，提升了试验结果的可信性，也可作为不同批次试剂间的比对平台，这对于解决手工类项目一贯缺乏有效质控的问题，无疑提供了一个新思路。

［1］陈方平.临床检验血液学［M］.北京:高等教育出版社，2006:127.

［2］叶应妩，王毓三，申子瑜.全国临床检验操作规程［M］.3版，南京:东南大学出版社，2007:168-169.

［3］阮萍，黄耀熊，李丹.新型快速显微多道分光光度技术对血红蛋白的光谱分析［J］.光谱学与光谱分析，2005，25(7):1121-1124.

［4］黄艳红，罗自强，秦晓群，等.利用改进的红细胞渗透脆性实验加强学生能力培养［J］.医学教育探索，2009，8(10):1226-1227.

［5］袁明生，易旺云，黄文东.溶血指数测红细胞渗透脆性的建立及在β-地中海贫血孕妇筛查中的应用［J］.中国优生与遗传杂志，2010，18(1):60，117.