SIRT2在浆液性卵巢癌细胞系中的表达及其对增殖、迁移和侵袭的影响*

杜燕华，张海燕，孙　红△(复旦大学附属妇产科医院，上海市女性生殖内分泌相关疾病重点实验室，上海000)

SIRT2在浆液性卵巢癌细胞系中的表达及其对增殖、迁移和侵袭的影响*

杜燕华1，2，张海燕1，孙红1△
(1复旦大学附属妇产科医院，2上海市女性生殖内分泌相关疾病重点实验室，上海200011)

［摘要］目的:研究SIRT2在卵巢表层上皮( ovarian surface epithelium，OSE)及浆液性卵巢癌( serous ovarian carcinoma，SOC)细胞系中的表达情况并从细胞增殖、迁移和侵袭这3个方面探讨SIRT2对SOC恶性生物学行为的影响。方法:运用Western blot技术检测OSE和SOC细胞系中SIRT2蛋白的表达水平;设计靶向SIRT2的siRNA，构建SIRT2过表达载体，分别瞬时转染OSE细胞系HOSEpiC和SOC细胞系HO8910，平板克隆形成实验和CCK-8实验研究SIRT2对细胞生长的影响;细胞划痕实验考察SIRT2在SOC细胞迁移中的作用; Transwell实验研究SIRT2 对SOC细胞侵袭能力的影响。结果: 5株SOC细胞系中SIRT2的表达水平显著低于OSE细胞系。在HOSEpiC细胞中沉默SIRT2，细胞克隆形成数增多，细胞活力增强。相反，在HO8910细胞中过表达SIRT2，细胞克隆形成数减少，细胞活力降低。沉默SIRT2促进HOSEpiC细胞的迁移，而过表达SIRT2则抑制HO8910细胞的迁移。沉默SIRT2的HOSEpiC细胞侵袭能力明显增加，而过表达SIRT2的HO8910细胞侵袭能力则显著降低。结论: SIRT2在SOC细胞中表达显著下调。SIRT2在OSE细胞中是肿瘤抑制蛋白，抑制细胞增殖、迁移和侵袭。

［关键词］SIRT2蛋白;浆液性卵巢癌;细胞增殖;细胞迁移;肿瘤侵袭

SIRT2是人类的III类组蛋白脱乙酰酶，在组织中存在广泛表达，参与细胞的正常生理或病理生理过程［1-2］。既往研究表明，SIRT2表达水平与癌症密切相关，但根据细胞来源和肿瘤类型的不同，SIRT2分别扮演着肿瘤抑制因子或肿瘤促进因子的角色。

卵巢上皮性肿瘤来源于卵巢表面的生发上皮，而生发上皮来自原始的体腔上皮，具有分化为各种苗勒上皮的潜能，若向输卵管上皮分化，则形成浆液性肿瘤。上皮性卵巢癌约占卵巢恶性肿瘤的98%，其中75%的上皮性卵巢癌为浆液性卵巢癌( serousovarian carcinoma，SOC)。目前关于SIRT2在SOC中的研究尚未有报道，本研究旨在明确SOC中SIRT2的表达水平并进一步揭示SIRT2对SOC的生长、迁移和侵袭等恶性生物学行为的影响。

材料和方法

1主要材料

人卵巢表层上皮( ovarian surface epithelium，OSE)细胞系HOSEpiC购自ATCC;人SOC细胞系SKOV-3、OVCAR433、HEY、CAOV3和HO8910均购自中国科学院细胞库。

细胞转染试剂Lipofectamine 3000购自Invitrogen;细胞DMEM培养基、RPMI-1640培养基、胎牛血清和0.25%胰酶-0.02% EDTA购自Gibco; SIRT2兔抗人I抗和β-actin鼠抗人I抗均购自Abcam; CCK-8试剂盒购自Dojindo; Matrigel购自BD; Transwell小室购自Millipore; siRNA由上海吉玛基因技术有限公司设计合成。

2实验方法

2.1细胞培养HOSEpiC、SKOV-3和OVCAR433细胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，HEY、CAOV3和HO8910细胞用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基，常规培养于5% CO2、37℃的培养箱。

2.2Western blot实验提取各细胞系总蛋白，BCA法测蛋白浓度，按每孔30 μg蛋白上样。恒压80 V电泳，恒压100 V转膜100 min，10%脱脂奶粉液封闭30 min，I抗4℃过夜，II抗室温孵育1 h后ECL发光显影。

2.3过表达载体的构建和细胞转染HO8910细胞提取总RNA，逆转录获得cDNA，以其为模板进行PCR扩增，切胶回收后，构建重组质粒pCMV-Myc，转化DH5α感受态大肠杆菌，挑选转化子，提取质粒，经酶切和测序鉴定。按照Lipofectamine 3000说明书操作，按照质粒或siRNA∶脂质体比例为1∶1.5转染细胞。

2.4克隆形成实验将转染8 h后的各组细胞消化收集，按每孔1 000个将细胞接种于12孔板中，每2～3 d换液，7 d后取出固定并用结晶紫染色，显微镜下计数大于10个细胞的克隆数。

2.5CCK-8实验将转染24 h后的各组细胞消化收集，按照每孔5 000个将细胞接种于96孔板中，分别在不同时点( 0、12、24、36、48、60和72 h)加入10 μL CCK-8试剂，37℃孵育1 h，在450 nm处测定各孔的吸光度( A)值，相对细胞活力( %) = (各组不同时点A值－空白孔不同时点A值) /(各组起点A值－空白孔不同时点A值)×100%。

2.6细胞划痕实验( wound-healing assay)将细胞按照每孔4×105个接种于6孔板中，转染48 h后，细胞融合度达95%以上，用无菌Tip头部划线，PBS清洗去除细胞碎片，加入无血清培养基，5% CO2、37℃培养，不同时点( 0和48 h)显微镜下观察并拍摄细胞向划痕区的迁移情况。

2.7Transwell侵袭实验将转染24 h的各组细胞消化收集，用无血清培养基重悬，按每孔1×105个细胞( 150 μL)加入到预铺好Matrigel的Transwell小室内，下室加入600 μL完全培养基，培养36 h后棉签擦掉上室细胞，甲醇固定30 min，0.1%结晶紫染色30 min，显微镜下随机取5个高倍视野计数穿膜细胞数，取平均值。

3统计学处理

本研究中的所有实验数据均采用统计软件SPSS 18.0进行分析。计量资料用均数±标准差( mean± SD)表示，组间差异比较采用单因素方差分析，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

结果

1 SIRT2在浆液性卵巢癌细胞系中的表达

我们对6株卵巢(癌)上皮细胞系的SIRT2表达水平进行了检测，这6株细胞系分别为OSE细胞系HOSEpiC细胞以及SOC细胞系HEY、HO8910、OVCAR-433、CAOV3和SKOV3细胞。Western blot结果显示SOC细胞系中SIRT2表达水平显著低于OSE细胞系( P＜0.01)，见图1。

Figure 1.The protein expression of SIRT2 in OSE cell line and SOC cell lines.Mean±SD.n = 3.＊＊P＜0. 01 vs HOSEpiC.图1　SIRT2在OSE细胞系和SOC细胞系中的表达情况

2 在HOSEpiC细胞中沉默内源性SIRT2或在HO8910细胞中过表达SIRT2

在SIRT2高表达的HOSEpiC细胞中分别转染靶向SIRT2的干扰RNA: siRNA1～3，均可显著下调内源性SIRT2的表达( P＜0.01) ;而SIRT2低表达的HO8910细胞转染pCMV-SIRT2-Myc载体，则可以显著增加细胞内的SIRT2表达水平( P＜0.01)，见图2。

Figure 2.Knockdown or overexpression of SIRT2 in the ovarian cell lines.Mean±SD.n =3.＊＊P＜0. 01 vs scramble;##P＜0. 01 vs SIRT2-Myc.图2　在卵巢(癌)细胞系中沉默或过表达SIRT2

3 SIRT2对卵巢(癌)细胞增殖能力的影响

我们分别利用平板克隆形成和CCK-8实验观察沉默SIRT2或过表达SIRT2对细胞增殖的影响。平板克隆形成结果显示，沉默SIRT2促进OSE细胞系HOSEpiC的恶性增殖( P＜0.05)，而过表达SIRT2则对SOC细胞系HO8910的增殖有显著抑制作用( P＜0. 01)。CCK-8实验发现细胞活力的改变与平板克隆形成实验一致，见图3。

Figure 3.The effect of SIRT2 knockdown or overexpression on ovarian cell proliferation.Mean±SD.n =3.*P＜0. 05 vs SIRT2 si-RNA-2;#P＜0. 05，##P＜0. 01 vs SIRT2-Myc.图3　沉默或过表达SIRT2对卵巢(癌)细胞增殖的影响

4 SIRT2对卵巢(癌)细胞迁移能力的影响

为进一步研究SIRT2对卵巢(癌)细胞迁移的作用，我们利用划痕实验分别观察沉默SIRT2或者过表达SIRT2对HOSEpiC和HO8910细胞迁移率的影响。我们发现，SIRT2显著抑制细胞的迁移，而沉默SIRT2则会导致细胞迁移率显著增加( P＜0.01)，见图4。

Figure 4.The effect of SIRT2 knockdown or overexpression on ovarian cell migration.Mean±SD.n = 3.＊＊P＜0. 01 vs SIRT2 si-RNA-2;##P＜0. 01 vs SIRT2-myc.图4　SIRT2对卵巢(癌)细胞迁移能力的影响

5 SIRT2对卵巢(癌)细胞侵袭能力的影响

我们发现，沉默SIRT2的HOSEpiC细胞侵袭能力显著提高( P＜0.05)，而过表达SIRT2的HO8910细胞侵袭能力受到抑制( P＜0.01)，见图5。以上结果提示，SIRT2表达的下调是造成SOC转移的关键因素之一。

讨论

卵巢癌是女性生殖器官三大恶性肿瘤之一，其中上皮性卵巢癌最为常见，其发病隐匿，进展迅速，病死率居妇科恶性肿瘤之首，在女性的死因中位于第5位［3］。

SIRT2是sirtuin家族重要的成员之一，介导组蛋白和非组蛋白的去乙酰化修饰，主要功能是维持基因组的稳定性，修复DNA损伤，调控有丝分裂，参与抗氧化应激及炎症反应，抗凋亡损伤等病理生理过程［4-7］。有研究证实，SIRT2参与癌症的发生和进展过程，且具有细胞来源或肿瘤类型的特异性。SIRT2在神经胶质瘤、头颈部鳞状细胞癌、食管腺癌、胃癌、黑色素瘤、非小细胞肺癌中低表达，而在急性髓性白血病、神经母细胞瘤、胰腺癌、肝细胞肝癌等肿瘤中高表达［8］。虽然SIRT2在多种肿瘤中的促癌或抑癌功能已被阐明，但SIRT2与SOC的关系尚未明确。我们的研究结果首次证实SIRT2在SOC细胞系中表达水平较OSE细胞系显著降低。我们推测SIRT2在卵巢癌中扮演着抑癌基因的角色，SIRT2表达下调是SOC发生的重要分子事件。

恶性增殖、侵袭和转移等是肿瘤难以治愈的重要因素。有研究表明，SIRT2的表达水平与肿瘤的上述恶性生物学行为密切相关，如SIRT2基因沉默后显著抑制了肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力［9-11］;在肺癌细胞系中过表达SIRT2则可以调节细胞增殖、凋亡及细胞周期［12-13］;同样，过表达SIRT2能显著抑制神经胶质瘤细胞的增殖以及克隆形成［14-15］。我们的研究结果显示，在高表达SIRT2的OSE细胞系HOSEpiC细胞中沉默SIRT2可以导致细胞克隆形成增多，增殖加快，同时细胞的迁移和侵袭能力增强;相反，在低表达SIRT2的SOC细胞系HO8910细胞中过表达SIRT2可以抑制细胞克隆形成和增殖速率，对细胞的迁移和侵袭也有显著的抑制作用。以上研究结果进一步证实，SIRT2在OSE中作为肿瘤抑制蛋白发挥抑癌作用，SIRT2表达水平降低是SOC恶性增殖、迁移和侵袭能力增加的关键因素之一。

近些年来，分子靶向药物在临床实践中取得显著疗效，将癌症治疗推向了一个前所未有的新阶段，然而SOC没有特异的生物标志物和治疗靶标。我们的研究结果将对卵巢癌的个体化靶向治疗提供新的分子生物学依据。

Figure 5.The effect of SIRT2 knockdown or overexpression on ovarian cell invasion.Mean±SD.n =3.*P＜0. 05 vs SIRT2 siRNA-2;##P＜0. 01 vs SIRT2-Myc.图5　SIRT2对卵巢(癌)细胞侵袭能力的影响

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Reduced expression of SIRT2 in serous ovarian carcinoma promotes cell proliferation，migration and invasion

DU Yan-hua1，2，ZHANG Hai-yan1，SUN Hong1
(1Obstetrics＆Gynecology Hospital of Fudan University，2Shanghai Key Laboratory of Female Reproductive Endocrine Related Diseases，Shanghai 200011，China.E-mail: hongsun57@ hotmail.com)

［ABSTRACT］AIM: To compare the expression of SIRT2 in ovarian surface epithelial ( OSE) cell line and serous ovarian carcinoma ( SOC) cell lines，and to investigate the effects of SIRT2 on the cell proliferation，migration and invasion.METHODS: The expression levels of SIRT2 in the OSE cell line and the SOC cell lines were determined by Western blot.The SIRT2 siRNAs and overexpression construct were designed and verified.Transient transfection of SIRT2 siRNAs or overexpression construct was performed，and the effect of SIRT2 on the cell proliferation，migration and invasion was evaluated.RESULTS: SIRT2 levels in the 5 strains of SOC cell lines were significantly lower than that in the OSE cell line.SIRT2 knockdown in HOSEpiC cells significantly enhanced the ability of cell colony formation and accelerated the cell growth rate.On the contrary，overexpression of SIRT2 in HO8910 cells dramatically repressed the number of cell colonies and cell activity.SIRT2 significantly changed the ability of ovarian cell migration.Knockdown of SIRT2 facilitated the cell invasion.CONCLUSION: The expression of SIRT2 in the SOC cells is significantly down-regulated.In the OSE cells，SIRT2 acts as a tumor suppressor and mediates the inhibition of cell proliferation，migration and invasion.

［KEY WORDS］SIRT2 protein; Serous ovarian carcinoma; Cell proliferation; Cell migration; Neoplasm invasion

通讯作者△Tel: 021-33189900; E-mail: hongsun57@ hotmail.com

*［基金项目］上海市科学技术委员会科研计划( No.14ZR1404100)

［收稿日期］2015-05-04［修回日期］2015-05-26

［文章编号］1000-4718( 2015)07-1209-05

［中图分类号］R730. 23; R737. 31

［文献标志码］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.07.010