肾络通对糖尿病肾病大鼠podocin、CD2AP的影响❋

潘利敏，方 超，娄菲菲，张江华，郭立芳，王月华，李 英

(1.河北医科大学第三医院，石家庄 050081;2.河北省中医院，石家庄 050011; 3.河北医科大学，石家庄 050017)

肾络通对糖尿病肾病大鼠podocin、CD2AP的影响❋

潘利敏2，方 超3，娄菲菲3，张江华3，郭立芳2，王月华1△，李 英1

(1.河北医科大学第三医院，石家庄 050081;2.河北省中医院，石家庄 050011; 3.河北医科大学，石家庄 050017)

目的:探讨肾络通(益气养阴消癥通络为法)对糖尿病肾病大鼠24 h尿白蛋白定量(UAlb)及肾组织podocin、CD2AP的影响。方法:70只大鼠随机选取10只作为正常对照组，其余60只大鼠均行腹腔注射STZ(55 mg·kg－1·d－1)1次，3 d后测空腹血糖≥16.7 mmol/L者按随机数字表法分为模型组、中药组及厄贝沙坦组，按各组相应药物剂量灌胃。于第24周末检测各组大鼠24 h UAlb定量，免疫组化法测肾组织podocin、CD2AP蛋白表达。结果:各治疗组与模型组比较24 h UAlb明显减少，podocin、CD2AP蛋白表达显著增加。结论:益气养阴、消癥通络中药肾络通可能通过减少podocin、CD2AP蛋白的丢失，使肾小球滤过膜的完整性得到一定程度的恢复，而减轻糖尿病肾病大鼠蛋白尿。

肾络通;糖尿病大鼠;24 h尿白蛋白定量;podocin;CD2AP

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)作为糖尿病的主要微血管病变，是糖尿病最常见的并发症之一。随着我国糖尿病发病率逐年升高，DN的发病率也随之上升，因此有效防治DN是糖尿病和肾病学者共同面临的一项重要工作。有研究表明，肾组织podocin、CD2AP等表达异常，与蛋白尿发生密切相关［1－2］。而前期研究已证实，益气养阴、消癥通络中药肾络通能够通过对DN大鼠nephrin的影响发挥对DN的治疗作用［3］。因此本研究继以DN动物模型为研究对象，观察肾络通(益气养阴消癥通络为法)对 DN大鼠 24 h尿白蛋白及肾组织podocin、CD2AP蛋白的影响，为中药复方制剂延缓DN提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物

本实验研究选用雄性清洁级SD大鼠70只，体质量(200±10)g，由河北医科大学动物中心提供(合格证号1312053)。

1.2 主要药物与试剂

肾络通由黄芪、玄参、地龙、僵蚕、乌梢蛇等组成，经粉碎、水煎浓缩至含生药3 g/ml(河北医科大学第三医院制剂室提供)，厄贝沙坦(由杭州赛诺菲圣德拉堡民生制药有限公司生产)，兔抗大鼠podocin、CD2AP蛋白抗体(武汉三鹰生物技术有限公司)，生物素标记的羊抗兔IgG、辣根过氧化酶HRP标记的羊抗兔IgG及链酶亲和素－生物素复合素(北京中杉公司)。

1.3 主要仪器

电子微量秤(奥豪斯公司)，ONETOUCH Ultra稳豪型血糖仪(美国强生公司)，全自动生化分析仪(美国贝克曼公司)，光学显微镜(上海光学仪器六厂)，超低温冰箱(illus公司)，数码像机(model Penguin 600CL，Pixera Inc，美国)，摇床(LSR－2AD，美莱博)。

1.4 方法

1.4.1 分组、造模及给药方法 70只大鼠适应性饲养1周后分别置代谢笼里取尿，测定尿蛋白及尿红细胞全部阴性，随机选取10只作为正常对照组，其余60只大鼠均行腹腔注射STZ(55 mg·kg－1·d－1)1次，3 d后尾尖采血。血糖仪测空腹血糖，血糖≥16.7 mmol/L者按随机数字表法分为模型组、中药组及厄贝沙坦组开始灌胃给药，中药组给予11.2 g·kg－1·d－1，厄贝沙坦组给予15 mg·kg－1· d－1(给药剂量参照文献［4］计算)，共给药24周。分别在实验第24周末于代谢笼里留取24 h尿后，采用全自动生化仪测定24 h尿白蛋白量，股动脉取血并取右侧肾组织待测。

1.4.2 免疫组化方法检测podocin、CD2AP蛋白表达 常规蜡块包埋肾组织，切片(厚度为4 um)抗原修复后，过氧化氢10 min，正常羊血清封闭30 min，再依次用一抗(4℃过夜)及二抗孵育(室温30 min)。以磷酸盐缓冲液及非免疫的兔血清代替一抗作为空白对照。DAB试剂盒显色后，苏木素复染细胞核，普通光镜下观察肾组织podocin、CD2AP蛋白的分布情况，应用ImagePro Plus图像分析软件测定各组OD值。

1.5 统计学方法

采用SPSS13.0统计软件进行统计分析，采用单因素方差分析，组间两两比较采用最小显著差异(LSD)法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠一般状况

实验过程中，模型组、中药组及厄贝沙坦组各有1只大鼠血糖恢复正常并剔除。正常对照组大鼠饮食正常，眼睛有神，被毛光泽，反应敏捷，粪便呈麦粒状，尿量正常。造模各组注射STZ后均出现明显的多饮、多食、多尿症状，并逐渐出现精神萎靡、反应迟钝、身体消瘦。治疗期间造模各组均有大鼠死亡情况，其中模型组和中药组死亡3只，厄贝沙坦组死亡2只，死亡原因可能为高血糖引起的代谢紊乱。

2.2 各组大鼠24 h尿白蛋白定量比较

表1显示，与正常对照组比较，模型组、厄贝沙坦组、中药组24 h尿白蛋白显著升高，差异有统计学意义(P＜0.01)。与模型组比较，厄贝沙坦组、中药组24 h尿白蛋白均有所降低，差异有统计学意义(P＜0.01)，厄贝沙坦组与中药组比较差异无统计学意义。

2.3 各组大鼠肾组织病理形态学观察

图1显示，正常对照组肾组织未见明显病理改变，模型组、中药组及厄贝沙坦组大鼠可见肾小球肥大，系膜区增宽，基质增加，肾小球基膜增厚，肾小囊腔变窄，各治疗组病理改变较模型组轻。

图1 各组大鼠光镜下病理形态学结果(PAS染色 ×400)

2.4 各组大鼠肾组织podocin、CD2AP免疫组化结果

图2、3表1显示，正常对照组肾组织可见podocin、CD2AP大量表达，模型组较正常组podocin、CD2AP表达明显减少，中药组及厄贝沙坦组较模型组podocin、CD2AP表达明显增加，各治疗组病理改变较模型组轻。

图2 各组大鼠光镜podocin免疫组化结果(×400)

图3 各组大鼠光镜CD2AP免疫组化结果(×400)

表1 各组大鼠U Alb和podocin、CD2AP比较(±s)

表1 各组大鼠U Alb和podocin、CD2AP比较(±s)

注:与正常对照组比较:＊＊P＜0.01;与模型组比较:▲▲P＜0.01

组 别 鼠数 U Alb(ug/24 h)podocin CD2AP正常对照组0.00 0.00 0.00 10 3.4±0.99 1.130±0.019 1.230±0.034模 型 组 16 94.8±2.43＊＊ 0.288±0.010＊＊ 0.340±0.026＊＊厄贝沙坦组 17 54.5±2.38＊＊▲▲0.428±0.014＊＊▲▲ 0.539±0.033＊＊▲▲中 药 组 16 55.3±1.92＊＊▲▲0.748±0.016＊＊▲▲ 0.638±0.020＊＊▲▲F3989.5 6162.95 1699.07 P

3 讨论

糖尿病肾病是常见的糖尿病微血管严重并发症之一，也是导致终末期肾衰竭的主要原因。因DN病程迁延，且临床上一旦出现大量蛋白尿则肾脏损害往往难以逆转，患者将逐渐进入终末期肾病并需要长期肾脏替代治疗，因此深入开展DN发病机制及防治措施的研究具有重要意义。

DN的主要临床表现为蛋白尿。肾小球滤过屏障由肾小球血管内皮细胞、基底膜、脏层上皮细胞(足细胞)足突构成，当肾小球滤过膜的完整性及其功能发生改变时则产生蛋白尿，即蛋白尿是反映肾小球滤过屏障对血浆蛋白通透性增高的特征性临床表现。足细胞足突通过 α3β1整合素与 α－βdystroglycans铆钉于肾小球基底膜(GBM)上;相邻足突之间的裂孔膜是肾小球滤过屏障的重要结构和功能单位，由nephrin、podocin、CD2AP等多种蛋白质分子组成［5］。研究发现，糖尿病肾病患者肾小球Nephrin表达减少，引起足细胞损伤脱落，滤过屏障功能破坏，通透性增加，尿蛋白排出增加［6］。podocin的羧基端结构域与CD2AP及nephrin相结合成蛋白复合体，介导裂孔隔膜与足突的细胞骨架相连。有研究表明，在肾小球提取物中这些蛋白可发生免疫共沉淀，提示在体内podoein与CD2AP和nephrin之间存在着相互作用［7］。由于CD2AP无论在体外还是体内均与nephrin有着直接的相互作用，因此CD2AP很可能在介导podocin与nephrin的相互作用中起衔接蛋白的作用。如果裂孔隔膜中任何一种关键成分nephrin、CD2AP或podocin出现表达改变时，均可能导致大量蛋白尿发生。除对维持裂孔隔膜的正常结构与功能具有重要作用外，CD2AP可与 nephrin及 podocin结合参与足细胞信号传导［8］。而前期研究已证实，益气养阴、消癥通络中药，即肾络通能够通过对DN大鼠nephrin的影响发挥对DN的治疗作用，因此本研究继以DN动物模型为研究对象，观察肾络通对 DN大鼠肾组织podocin、CD2AP蛋白的影响。

课题组认为，DN的基本病机是气虚无力运血而致血瘀，阴虚火旺、煎熬津液、津亏液少则血液黏稠不畅而致“阴虚血瘀”，病久不愈深伏于肾络渐成微小癥积，致使肾体受损、肾用失司导致DN的发生。结合“病久必瘀、病久入络”的中医学理论，提出该病证病位在络，“瘀血癥积阻于肾络”可能是病机之关键，同时结合DN气阴两虚的基本病机，经过临证的反复筛选，确定了一个相对固定治疗DN的基本方肾络通，以消癥通络为主兼以益气养阴。其中黄芪、玄参益气养阴，地龙、僵蚕、乌梢蛇、鳖甲等消癥通络，取得了较好的临床疗效。综合以上研究，足细胞及其裂孔隔膜中任何一种关键成分nephrin、CD2AP或podocin损伤在DN发病中的作用已经确定，探索以足细胞为靶点的治疗机制对探讨新的DN治疗和预防手段具有极其重要的意义。本实验结果显示，实验第24周造模各组podocin、CD2AP蛋白显著下降，与上述报道一致。而进一步观察模型组podocin、CD2AP蛋白表达低于其他各组，中药组及厄贝沙坦组均能使肾组织中podocin、CD2AP蛋白表达上调，提示益气养阴、消癥通络中药及厄贝沙坦可能通过减少podocin、CD2AP蛋白的丢失，使肾小球滤过膜的完整性得到一定程度的恢复而减轻蛋白尿。中药组与厄贝沙坦组比较差异无统计学意义，但中药长期疗效发挥有待进一步的研究。

［1］Yasuno K，Araki S，Sakashita H，et al.Development of podocyte injuries in osborne－mendel rats is accompanied by reduced expression of podocyte proteins［J］.J Comp Pathol，2013，pii:s0021－9975(13):00029－7.

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［3］王月华，潘利敏，方超，等.肾络通对糖尿病肾病大鼠裂孔膜蛋白的影响［J］.中国中医基础医学杂志，2014，20(11): 1496－1498.

［4］黄继汉，黄晓辉，陈志杨，等.药理实验中动物间和动与人体间的等效剂量换算［J］.中国临床药理学与治疗学，2004，9 (9):1069－1072.

［5］Lehtonen S，Ryan J J，Kudlicka K，et al.Cell Junction－associated proteins IQGAPI，MAGl－2，CASK，spectrins and alphaactinin are components of the nephrin multiprotein in complex［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2005，102(28):9811－9819.

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Effects of Shen Luo Tong on CD2AP and Podocin in Rats with Diabetic Nephropathy

PAN Li－min2，FANG Chao3，LOU Fei－fei3，ZHANG Jiang－hua3，GUO Li－fang2，WANG Yue－hua1△，LI Ying1
(1．No 3 Hospital，Hebei Medical University，Shijiazhuang 050081，China; 2．TCM Hospital of Hebei Province，Shijiazhuang 050011，China;3．Hebei Midical University，Shijiazhuang 050017，China)

Object:To investigate the effects of Shen Luotong(Supplementing Qi－Nourishing Yin－Dispersing Blood Stasis－Dredging Collateral Recipe)on 24 hour UAlb，podocin and CD2AP in earlier diabetic nephropathy(DN)rats. Methods:Select 10 rats randomly from 70 rats as control group and inject the rest 60 rats in their enterocoelia with STZ(55 mg·kg－1·d－1)once.Rats with FBG over 16.7mol/L after 3d were randomly divided into three groups:model group、Chinese medicine group and irbesartan group.The 24 hour UAlb，podocin and CD2AP protein expression were tested by the end of the 24th week.Result:Compared with model group，24 hour UAlb in treated groups decreased significantly.But the protein expression of podocin and CD2AP in treated groups increased significantly in contrast with model group. Conclusion:Supplementing Qi－Nourishing Yin－Dispersing Blood Stasis－Dredging Collateral Recipe—Shen Luotong has a preventing function on kidney in the loss of podocin and CD2AP protein，thus recovering the integrity of glomerular filtration membrane to a certain extant which can lessen the albuminuria of diabetic nephropathy(DN)rats.

Shen Luotong;Diabetic rats;24 hour UALB;Podocin;CD2AP

R285.5

:B

:1006－3250(2015)12－1511－03

2015－04－11

国家自然科学基金资助项目(81202829)－益气养阴消癥通络法对糖尿病肾病大鼠及高糖诱导足细胞的影响

潘利敏(1970－)，女，河南通许人，主任医师，医学硕士，从事内科疾病的临床与基础研究。

△通讯作者:王月华(1973－)，女，主任医师，医学博士，硕士研究生导师，从事慢性肾脏病的临床与基础研究，Tel: 18533112216，E－mail:wangyuehua@medmail.com.cn。