差异蛋白质组学在中医药领域研究路线及应用现状❋

李 礼，樊小农，付静静，沈 燕，王 舒△

(1.天津中医药大学研究生院，天津 300193;2.天津中医药大学第一附属医院针灸研究所，天津 300193; 3.青岛市海慈医疗集团，山东青岛 266000)

差异蛋白质组学在中医药领域研究路线及应用现状❋

李 礼1，樊小农2，付静静3，沈 燕2，王 舒2△

(1.天津中医药大学研究生院，天津 300193;2.天津中医药大学第一附属医院针灸研究所，天津 300193; 3.青岛市海慈医疗集团，山东青岛 266000)

差异蛋白质组学从整体角度分析在不同状态下体内蛋白质表达的动态演变过程，其研究方法与传统中医强调整体观的思想相符合。故创新性地剖析差异蛋白质组学应用于中医证候学、中药学和针灸学领域的研究路线，如证候实质研究、同病异证、异病同证、同类证等证候学研究，药材炮制及道地性、中药作用机制靶点及方证相关等中药学相关研究，以及经穴特异性、针刺量效关系、脏腑相关及针灸疗效作用机制等针灸学领域研究。同时，归纳分析差异蛋白质组学在相关领域的应用现状及局限性。

差异蛋白质组学;研究路线;中医证候学;中药学;针灸学

差异蛋白质组学是一种通过与正常生理状态下蛋白质的表达进行比较分析，明确疾病病理变化过程或治疗干预作用机制的方法［1］，可避免短期内不能实现获得有关生命活动的“全景式信息”的弊端［2］。差异蛋白质组学从整体角度分析在不同状态下体内蛋白质表达的动态演变过程，其研究方法与传统中医强调人与社会环境的整体观、辨证施治等思想相符合［3］。将差异蛋白质组学研究方法应用于中医药领域，为传统中医的研究打开一扇新的大门。

差异蛋白质组学的核心在于筛选、鉴定并验证差异表达蛋白质，随后从生物信息学、系统生物学角度分析差异表达蛋白。双向电泳(2－DE)、质谱技术(MS)、蛋白质芯片是蛋白质组学技术的基础，蛋白质数据库、生物信息学和系统生物学为蛋白质组学研究结果的解译提供信息支撑。差异蛋白质组学在中医药学科可广泛应用于中医证候、中药及针灸等领域。

1 中医证候学

中医证候是疾病过程中某一阶段或某一类型的病理概括，一般由1组相对固定、有内在联系且能揭示疾病某一阶段或某一类型病变本质的症状和体征构成，可以反映病变的机理和发展趋势。其功能的实现以物质为基础，微观水平的蛋白质表达及翻译后修饰是机体整体功能状态的物质基础。

1.1 研究路线

图1显示，通过某一证型对比健康群体、相同疾病不同证型、不同疾病相同证型、不同疾病相类似证型或同一患者不同证候阶段的差异蛋白质组学分析，鉴定出差异蛋白点，结合生物信息学分析，探索证候的分子生物学实质，促进证候学研究的现代化进程，为中医辨证提供定量化、客观化的蛋白质组学依据，或以证型间相对固定的差异蛋白为基础，建立此类差异蛋白为生物标记物的证候模型，进一步指 导治法方药作用机理的研究。

图1 中医证候学的差异蛋白质组学研究路线

1.2 对比健康群体证候实质研究

研究者尝试通过气虚血瘀模型［4］、脾阴虚模型［5］对比假手术组和正常组大鼠探索相应的证候实质。根据研究结果推测气虚血瘀证实质可能与能量代谢障碍(苹果酸脱氢酶、磷酸丙糖异构酶)、氧化损伤(谷胱甘肽过氧化物酶、NADH脱氢酶的铁硫蛋白8)和缺血心肌保护的应激反应(αB－晶状体蛋白)有关，但其生物信息学分析尚不完善，也未进行后期验证。而脾阴虚的研究中仅提取出模型大鼠与正常大鼠海马组织的差异蛋白点，尚未进行差异蛋白鉴定及验证相关工作。此外，刘希成等［6］对比老年肾阳虚人群和老年健康人群血清样本，发现并鉴定验证8类49种差异表达蛋白(如免疫应答相关GA结合蛋白α链、钙调蛋白功能相关降钙素前体蛋白)。但此研究并未提供2组血清提供者的相关信息，无法确定此类差异蛋白是否为肾阳虚的特异性蛋白。

1.3 同病异证

此类研究在冠心病［7］(心气虚和痰浊内阻证)、慢性肾衰竭［8］(湿证和非湿证)等病种中已有相关报道。研究结果提示，心气虚和痰浊内阻证冠心病患者(各9例)的血清蛋白表达水平在血液连锁反应系(补体成分C3、抗凝血酶III等)及血脂代谢(载脂蛋白H、载脂蛋白E等)等体内代谢通路方面均表现出差异，而慢性肾衰竭可由4个尿液差异蛋白峰(m/z分别为 8654.96、2081.65、18667.3、2242.14)组成的生物标记物，将中医湿证组和非湿证组样本较好地分类，但未能通过数据库实现关联蛋白鉴定。

1.4 异病同证、同类证

值得推崇的是，熊新贵等［9］尝试通过4种不同疾病的不同证型，脑出血(肝阳化风证和阴虚风动证)、脑梗死(肝阳化风证和阴虚风动证)、颈椎病(肝阳化风证和肝阳上亢证)和帕金森病(肝阳化风证和血虚生风证)探索同病异证、异病同证、同类证(肝阳化风、血虚生风、阴虚风动)的实质，发现同病异证之间的相同蛋白少、差异蛋白多，不同疾病的肝阳化风证有13种共同表达蛋白(核糖核酸核蛋白K、硫氧还蛋白过氧化物还原酶、凝血酶1、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶等)，不同疾病的相类似证候(肝阳化风证、阴虚风动证、血虚生风证)也存在相同的蛋白表达(硫氧还蛋白依赖性过氧化物酶TPx)。根据研究结果推测，相同疾病不同发展阶段的不同证候具有相对特异的物质基础(差异表达的蛋白)，不同疾病的相同证候或相类似证候源自于共同的物质基础。

目前尚无研究者从同一患者不同证候阶段的差异蛋白质组学角度进行证候实质性研究。

2 中药学

中药是我国传统医药中最伟大的宝库之一，但中药本身的复杂性、来源的多样性及多以复方为主的临床应用模式都为中药现代化研究提出了严峻挑战，对这种多靶点、多环节、多层次的中药现代化研究，应通过多角度、多技术、多学科交叉的方式进行。

2.1 研究路线

图2显示，结合药物疗效差异分析，中药的差异蛋白质组学分析可从2个方向进行，即从药物本身物质基础方面进行中药炮制及道地性等研究，为中药鉴定、质量控制提供实验基础;以药物不同部位为切入点进行差异蛋白质组学分析，有可能提高药物原材料利用率;或是比较中药干预前后、不同药物干预、不同组方药物、不同剂量药物干预后受试体的效应相关样本的差异表达蛋白，再进行药效与差异表达蛋白的关联性分析，探索有效成分、靶点蛋白等作用机制，并有可能建立量效关系和优化中药处方。此外，将证候与中药结合进行差异蛋白质组学分析，也可为方－证相关提供分析生物学水平的理论支撑。

2.2 药材炮制及道地性研究

李冰宁等［10］发现，炮制会影响水蛭蛋白质含量及存在形式，影响其抗凝作用，推荐鲜品入药。尽管此研究所选药物品种并不具有代表性，且缺乏完善的研究路线，但却为中药炮制学今后的研究方法提供了方向性依据。包华音等［11］分析不同产地壁虎及其肢体不同部位的水溶性蛋白质，发现不同产地壁虎同一部位、同一产地不同部位壁虎的蛋白质含量都存在差异，但未深入分析其差异蛋白质种类及其与药性的关系。

目前尚无研究者利用差异蛋白质组学分析进行中药道地性研究，且尚未形成以药物蛋白质组学为基础的药材质量控制标准。

图2 中药学的差异蛋白质组学研究路线

2.3 药物作用机制及靶点研究

刘鹏等［12］研究清热解毒凉血化瘀浸膏对内毒素肝损伤大鼠蛋白质表达的影响，推测中药干预组中高表达(相对分子质量为4200道尔顿)和低表达(8984道尔顿、9005道尔顿)蛋白质可能是清热解毒凉血化瘀干预内毒素肝损伤大鼠的重要分子机制。郑健、艾斯等［13－14］探索肾康灵对阿霉素肾病大鼠血清和尿液蛋白质谱表达的影响，推测血清差异表达蛋白(m/z分别为8837.7、15013.0、15053.2)和尿液差异表达蛋白(m/z分别为9321.0、9393.1、9477.5)，可能为中药肾康灵靶向作用的蛋白点。上述研究者提出考虑进一步鉴定差异蛋白质，并结合临床验证差异蛋白的药物靶向性，但目前并未见后续研究报道。

2.4 方－证相关

胡小勤等通过高血压病气虚血瘀证患者对比健康者血清进行补阳还五汤与高血压病气虚血瘀证“方证相关”研究，发现鉴定出8个高血压病气虚血瘀证患者与健康对照者差异蛋白点(上调蛋白肽基脯氨酰异构酶A、肽基脯氨酸顺反异构酶A样1亚型等，下调蛋白丙酮酸激酶同工酶M1亚型、抑制蛋白－1等)，而补阳还五汤含药血清处理后与空白血清处理后的差异蛋白点共3个(上调蛋白丙酮酸激酶CRA－c亚型、热休克蛋白27，下调蛋白膜蛋白A1，CRA－b亚型)，初步推测上述差异蛋白可能为补阳还五汤对高血压气虚血瘀证的作用靶点，其作用机制为抑制细胞凋亡［15］。

目前尚无研究者从不同药物、不同组方或是不同剂量干预后的样本差异蛋白质组学角度探索中药作用机制。

图3 针灸学的差异蛋白质组学研究路线

3 针灸学

经络腧穴理论及针灸是中国数千年历代医家累积的另一份宝贵财富，已在国际医疗卫生保健领域占有一席之地。针灸的治疗作用是建立在腧穴经络理论的基础上的。20世纪以来，研究者不断通过各种方法试图解释腧穴经络针灸的内涵。尽管目前尚未形成可以完全解释针灸学原理的框架，但困难并不能阻止研究者在针灸学领域的不断探索。

3.1 研究路线

图3显示，有研究者通过穴位、经络通路沿线、非特异性组织和脏腑组织之间蛋白质组成的异同点及其针刺前后相关位置蛋白质组成种类与数量异同分析，尝试寻找经穴特异性、经穴循经特异性、经穴脏腑相关的物质基础。也有通过针刺干预前后特定效应相关物质蛋白质表达水平的变化，探讨针灸作用于特定疾病的机理。此外，可以考虑通过不同的穴位组合(不同的经络选穴、经验用穴、辨证选穴等)、不同的刺激方法(电针、手针、灸法等)或不同的刺激量(提插补泻、不同频率等)干预前后疗效分析结合差异蛋白质组学分析，研究经穴效应循经特异性、针刺量效关系，并为针灸治疗方案标准化提供理论依据。

3.2 经穴特异性、经穴脏腑相关

张小卿、李春日等［16］对Wistar大鼠太溪穴、非经非穴处结缔组织和肾脏组织进行比较分析，发现肾脏－太溪穴的相关蛋白点多于肾脏－非经非穴相关蛋白点，初步推测肾经原穴太溪与其所属脏腑肾脏之间的密切联系与蛋白质有关。随后他们［17］发现，针刺足少阴肾经太溪穴可以影响肾脏蛋白质组学，上调能量代谢相关蛋白(NAD依赖性异柠檬酸脱氢酶)和醌相关抗氧化相关蛋白(醌还原酶)，进一步证实太溪穴与肾脏的联系。几位研究者采用渐进式研究思路，从初步探索到确定方向深入研究，是中医药理论基础研究的重要路线。

3.3 针灸疗效作用机制

Pan等［18］发现，电针对缺血性中风的神经保护调节机制可能为激活多种补体(上调补体1、C3、C4B，下调丝氨酸蛋白酶抑制因子G1)，抑制细胞凋亡和抗血栓形成(上调β－2糖蛋白1)，并可能通过上调凝溶胶蛋白促进四肢肌力恢复。Gao等［19］通过电针足三里和阳陵泉治疗大鼠慢性压迫性损伤所致的神经性疼痛的实验，推测电针止痛效果是通过调控有关氨基酸代谢的海马蛋白(如天冬氨酸转氨酶1等)和激活促分裂素原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路(如髓鞘碱性蛋白MBP)。XU等［20］对针刺前后哮喘大鼠肺部组织蛋白质组进行分析，发现针灸在不同水平上通过多个节点蛋白质调节炎症信号通路(下调S100A8、RAGE、S100A11等促炎蛋白质，上调CC10、ANXA5、sRAGE等抗炎蛋白)，对这些炎症相关蛋白的调节至少部分介导针灸的平喘效果。Lai等［21］发现，针刺对自发性高血压大鼠的降压效果可能是通过上调SHR大鼠延髓中的抗氧化酶(谷氨酸脱氢酶1、醛脱氢酶2、超氧化物歧化酶等)实现的。

目前差异蛋白质组学应用于针灸领域的研究质量相对较高，成果更为显著，但也仅限于针对针灸治疗特定病种机制研究，并未就针灸特色理论(如不同穴位组合、不同的刺激方法、不同刺激量)有更好的发挥。

4 总结

差异蛋白质组学在中医药领域应用极具研究价值，但目前尚存在一定的局限性:首先是技术方面，蛋白质组学技术在蛋白质分离、鉴定、自动化方面仍需不断完善，在大数据处理、生物信息学分析和系统生物学分析等方面也存在极大的挑战，且试验费用相对高昂，广泛推广受限。其次，当前研究路线多不完整，不能完全发挥差异蛋白质组学的优势(确定差异蛋白点－关联差异蛋白－差异蛋白验证－生物信息学分析)。再次，目前中医药领域的蛋白质组学研究多是动物实验，临床研究的总数和单个研究的样本量都较少，动物实验结果缺乏临床验证过程，这一现状影响研究结果的准确性、灵敏度和特异性，直接导致结果的推广受限。最后，中医药领域研究的参与者多数为中医药方面专业人员，因此对生物信息学、系统生物学知识掌握的深度和广度有限，所以往往在得出结果后分析不够完善，未能达到丰富中医药理论内涵的目的。

中医药作为中国医学的知识宝库，尚有很多精髓有待继续研究。差异蛋白质组学的应用尚有许多问题不容忽视，但随着技术的不断发展，生物信息学和系统生物学研究的深入，研究路线的不断改善，多学科合作的广泛开展，差异蛋白质组学将为中医药特色理论的解读做出独特贡献。

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Research Route and Application in Differential Proteomics in Traditional Chinese Medicine

LI Li1，FAN Xiao－nong2，FU Jing－jing3，SHEN Yan2，WANG Shu2△
(1．Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China; 2．The First Teaching Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China; 3．Hiser Medical Group of Qingdao，Qingdao 266000，China)

Differential proteomics，focusing on overall differentially expressed protein，correspond to essential idea of traditional Chinese medicine—holism.The authors proposed few research strategies for the proteomic studies in 3 basic fields of Chinese medicine—diagnosis(for instance，essence of TCM syndrome，same disease with different syndromes，different diseases with same syndrome，and similar TCM syndromes)，Chinese materia medica(processing of Chinese medicine，geo－herbalism，drug target，and formula－syndrome correlation)and acupuncture and moxibustion(acupoint specificity，dose－effect relationship，acupoint－internal organ correlation and mechanism of acupuncture)，furthermore，summarized current status of differential proteomics in the research of traditional Chinese medicine and pointed out several limitations based on current reports.

Differential proteomics;Research strategy;Syndrome of TCM;Chinese materia medica;Acupuncture and moxibustion

R22

:A

:1006－3250(2015)12－1602－05

2015－02－19

国家973项目(2012CB518505);天津市高等学校科技发展基金计划项目(20100221);高等学校博士学科专项科研基金(2011120110001)

李 礼(1990－)，女，安徽人，在读硕士，从事针灸作用机制及针灸治疗高血压作用机理的临床与研究。

△通讯作者:王 舒(1965－)，男，山东人，教授，医学博士，从事针灸治疗中风、偏头痛及高血压作用机理的临床与研究，Tel:022－27432207，E－mail:wangs2008@163.com。