杜仲总黄酮体外抗乙型肝炎病毒的实验研究

余 晓，罗 果（遵义医学院：.生物化学教研室；.医学与生物学研究中心，贵州遵义563000）

杜仲是中国特有的名贵中药材和工业原料树种。研究表明，杜仲含许多有效药用成分，如黄酮类、木脂类、萜类、糖类、生物碱和抗真菌蛋白等[1]，其中黄酮类化合物具有抗病毒、抗衰老、抗氧化、抑菌、降脂减肥[2]、抗癌防癌等作用[3]。

乙型肝炎是由嗜肝的乙型肝炎病毒（HBV）引起的一种在世界范围的传染性疾病，全世界约有3.5亿人感染HBV，我国约占一半。乙型肝炎给人类健康造成极大的危害，寻求高效低毒的抗HBV的天然药物已经刻不容缓[4]。本实验拟用转染HBV的人肝癌细胞HepG2.2.15作为研究对象[5]，观察杜仲总黄酮抗HBV的效果，为杜仲抗HBV的药效成分筛选以及杜仲天然产物的开发利用提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料 杜仲皮采自贵州省正安县田生村。转染HBV的人肝癌细胞系HepG2.2.15购自中国典型培养物保藏中心。

1.1.2 试剂 HBV荧光定量试剂盒（达安基因公司）；DMEM细胞培养液（GIBCO公司）；乙型肝炎e抗原（HBeAg）、乙型肝炎表面抗原（HBsAg）试剂盒（华美公司）；胎牛血清（四季青公司）；芦丁标准品（中国药品生物制品检定所，批号：100080-200806）。拉米夫定[葛兰素史克制药（苏州）有限公司，批号：10090046]。

1.1.3 主要仪器 荧光定量PCR仪（美国Bio-Rad公司）；ELX800通用酶标仪（美国Bio-techInc公司）；CO2孵箱（美国Thermo公司）。

1.2 方法

1.2.1 杜仲总黄酮的提取与含量测定 将杜仲皮制成粉状，采用乙醇分段（60%～90%）提取法提取，醋酸铅胺沉淀过滤，浓缩后过大孔树脂、聚酰胺和硅胶柱，将过柱后样品与标准品芦丁对照，测得总黄酮含量为69%。

1.2.2 杜仲总黄酮对HepG2.2.15细胞的毒性实验 取对数生长期的HepG2.2.15细胞，用细胞培养液调整细胞浓度为 1×105mL-1，将细胞接种于 96 孔板，每孔 200 μL，待其贴壁后，弃掉原培养液。在杜仲总黄酮不同剂量组各孔分别加入总黄酮浓度为 25、50、100、200 μg/mL 培养液200 μL，另设不加药细胞培养孔为空白对照组，每组重复6孔。将各组细胞置CO2孵箱培养72 h，采用MTT法测定各组细胞在490 nm处的OD值。计算不同浓度杜仲总黄酮对HepG2.2.15细胞生长抑制率[6]。细胞生长抑制率（%）=（空白对照组OD值-杜仲总黄酮不同剂量组OD值）/剂量组OD值×100%。根据Reed-Muench公式计算半数毒性浓度（TC50）。

1.2.3 不同浓度杜仲总黄酮对HBV-DNA的作用 按1.2.2项下方法加入不同浓度的杜仲总黄酮药液，另设药物拉米夫定（50 μg/mL）为阳性对照，每组重复3孔。置CO2孵箱培养72 h后，取细胞培养上清液提取HBVDNA，采用Real-time PCR法测定HBV-DNA拷贝数。记录阈值（Ct值），计算各样品的HBV-DNA起始拷贝数和抑制率[7]。DNA抑制率=（空白对照组拷贝数-剂量组拷贝数）/空白对照组拷贝数×100%。

1.2.4 细胞培养上清液中HBsAg和HBeAg含量测定按1.2.2项下方法加入不同浓度的杜仲总黄酮药液并设置空白对照组，收集各组细胞培养的上清液进行酶联免疫吸附试验（ELISA）测定。测定方法按照试剂盒操作说明进行。用酶联免疫检测仪测定450 nm处OD值，并计算抑制率[8]。HBsAg或HBeAg抑制率=（空白对照组OD值-剂量组OD值）/空白对照组OD值×100%。

1.3 统计学处理 应用SPSS13.0统计软件进行数据分析，计量资料以ss表示，采用方差分析。Р＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 杜仲总黄酮对HepG2.2.15细胞的毒性实验 杜仲总黄酮各剂量组（25、50、100、200 μg/mL）的 OD 值均低于空白对照组，说明杜仲总黄酮对HepG2.2.15细胞的生长有抑制作用。其中，杜仲总黄酮 50、100、200 μg/mL剂量组的抑制率与空白对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表 1。提示杜仲总黄酮的 TC50＞200 μg/mL，因此，本实验选取小于或等于200 μg/mL的浓度检测杜仲总黄酮的抗HBV作用。

表1 杜仲总黄酮对HepG2.2.15生长的抑制作用

2.2 不同浓度杜仲总黄酮对细胞上清液中HBV-DNA的影响 用杜仲总黄酮和拉米夫定分别作用细胞72 h，应用Real-time PCR法检测细胞培养上清液中HBVDNA的拷贝数。结果显示，杜仲总黄酮各剂量组和拉米夫定对HBV-DNA的复制均有抑制作用，与空白对照组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表 2。

表2 杜仲总黄酮、拉米夫定对细胞上清液中HBV-DNA的影响

2.3 杜仲总黄酮对HepG2.2.15细胞培养上清液中HBsAg和HBeAg含量的影响 用杜仲总黄酮和拉米夫定分别作用72 h，ELISA法测定细胞分泌HBsAg和HBeAg量，采用OD值表示。结果显示，杜仲总黄酮各剂量组和拉米夫定对HBsAg及HBeAg的分泌均有抑制作用，与空白对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表 3、4。

表3 杜仲总黄酮、拉米夫定对HepG2.2.15细胞分泌HBsAg的抑制作用

表4 杜仲总黄酮、拉米夫定对HepG2.2.15细胞分泌HBeAg的抑制作用

3 讨 论

黄酮类化合物是杜仲主要活性成分之一，具有抗氧化、调节血脂、抗肿瘤、抗病毒、抗骨质疏松、增强免疫力等多种功效。目前已经有其他物种的黄酮抗HBV的研究报道[9-11]，而对杜仲黄酮抗HBV的相关研究报道较少。

本研究以转染HBV的HepG2.2.15细胞为研究对象，该细胞能持续分泌HBV和相关抗原，研究杜仲总黄酮对该细胞分泌HBsAg、HBeAg和HBV-DNA的影响[12]。结果显示，不同浓度的杜仲总黄酮和拉米夫定均对HBVDNA复制有较强的抑制作用。细胞培养上清液中HBsAg和HBeAg检测表明，不同浓度的杜仲总黄酮、拉米夫定均对HBsAg和HBeAg的有抑制作用，其中对HBV-DNA的复制抑制作用强于对HBsAg和HBeAg的作用，说明总黄酮抗HBV的机制可能与抑制病毒DNA复制有关。研究结果表明，杜仲总黄酮在体外具有抗HBV的作用，但是其全面的抗病毒作用还需结合动物体内试验来证明，其抗病毒机制还有待进一步研究。

[1]刘丽君.杜仲化学活性成分及其药理学研究概况[J].亚太传统医药，2013，9（5）：82-83.

[2]张丽欣，李垚.植物黄酮抗病毒作用的研究进展[J].黑龙江科学，2010，1（3）：33-37.

[3]赵德义，高锦明，许爱遐，等.杜仲黄酮指纹图谱研究[J].西北植物学报，2003，23（11）：1988-1990.

[4]刘健.联合抗病毒治疗慢性乙型肝炎新进展[J].临床合理用药杂志，2013，6（26）：174-176.

[5]叶军，明安萍.板蓝根颗粒药物血清对HepG2.2.15细胞分泌HBsAg、HBeAg的影响[J].湖北中医药大学学报，2012，14（6）：10-12.

[6]周艳萌，吴中明，向晓波.土贝母皂苷体外抗乙型肝炎病毒的药效研究[J].时珍国医国药，2006，17（11）：2134-2136.

[7]王玉，吴中明，敖弟书.紫花地丁抗乙型肝炎病毒的实验研究[J].中药药理与临床，2011，27（5）：70-74.

[8]韦京辰，杨新平，李俊，等.青钱柳提取物对HepG2.2.15细胞HBsAg和 HBeAg 表达的影响[J].中成药，2012，34（7）：1220-1224.

[9]朱华，梁东艳，笪舫芳.拳卷地钱总黄酮提取物抗乙型肝炎病毒体外实验研究[J].大众科技，2013，15（164）：110-111.

[10]夏星，郑作文，谭为.白背叶黄酮类化合物抗鸭乙型肝炎病毒活性研究[J].中国药房，2010，21（7）：590-592.

[11]郭姗姗，高英杰，时宇静，等.一枝蒿总黄酮体外抗乙肝病毒作用机理的实验研究[J].中国实验方剂学杂志，2009，15（10）：72-74.

[12]冉贤金，胡虞乾.氧化苦参碱和拉米夫定体外抗乙肝病毒的比较[J].中国生化药物杂志，2012，33（2）：142-144.