重组毕赤酵母中腺苷甲硫氨酸的纯化*

傅梦月，张建国，张继宁

1(上海理工大学 医疗器械与食品学院，上海，200093)2(上海市农业科学院生态环境保护研究所，上海，201403)

腺苷甲硫氨酸(S-Adenosyl-L-methionine，SAM)在生物体中发挥着多种重要的生物功能［1］。而且，SAM处于多种代谢物的代谢途径的中心位置。实际上SAM分子中每一部分都会转化为有用的中间代谢物。在临床上，SAM可以用来治疗抑郁症、骨关节炎、纤维肌痛、老年痴呆症等［2］。1999年美国食品和药品监督管理局批准将其作为营养强化剂添加到食品中。在欧洲，SAM在70年代就在市场上销售了。近年来，有关SAM的生产一直是科研和工业界人员关注的热点。SAM的生产可以来自化学合成法，以ATP和L-甲硫氨酸为底物的酶促反应，以带有高活力的腺苷甲硫氨酸合成酶的微生物发酵方法。其中微生物发酵方法由于产量高，成本低，产物中S，SSAM比例高而获得广泛认可。很多微生物都被报道用于积累 SAM，例如拟球酵母属［3］，面包酵母［4］，酿酒酵母［5］，产元假丝酵母［6］，乳酸克鲁维酵母［7－8］，大肠杆菌等［9］。经过筛选［10］和突变后［11－12］的微生物菌种发酵所得最高产量为10.08 g/L［4］。用基因工程法重组的酿酒酵母［13］和毕赤酵母［14］也是生产SAM的重要微生物资源。毕赤酵母由于SAM合成酶表达的严格控制机制［14］，发酵工艺易于操作，细胞高密度等优点而被广泛研究［15］。例如，ZHANG从细胞浓度和甲醇的浓度方面入手，以细胞维持能为指标优化SAM的产量［16］。SAM的产量还受到培养液中铵离子浓度［17］，氧载体和辅助碳源［18］的明显影响。

有关SAM的分离纯化工艺的报道并不多。这可能与SAM在中性和碱性条件下不稳定有关。SAM纯化工艺的部分阶段的研究，例如细胞破碎、SAM的稳定性都有所报道［19－20］。LIU运用有机酸沉淀的方式获得SAM硫酸盐的回收率为60%，SAM硫酸和对甲苯磺酸双盐的回收率为60%［21］。由于含有微量杂质SAM非常容易吸潮，其纯度是纯化工艺的重要指标。本研究报道了从重组毕赤酵母中纯化SAM的具有较高纯度和回收率的完整工艺。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 毕赤酵母和树脂

重组具有酿酒酵母SAM合成酶基因(Sam2)的毕赤酵母，以醇氧化酶I启动子表达SAM合成酶。表达质粒pPIC9K的α-信号肽在应用前被切除［18］。大孔树脂购自上海华震科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 发酵工艺

毕赤酵母在YPD培养基(10 g/L酵母粉，20 g/L蛋白胨，20 g/L葡萄糖，固体培养基时需要添加20 g/L琼脂粉)生长后(30℃直到OD600为2～10)，接种到发酵罐(BLBIO-2GL，上海百伦生物科技有限公司)中培养(4%接种量)。发酵罐中含有1.5 L基础盐培养基(basic salt medium，BSM)。BSM培养基的组分为 40 g/L 甘油，18.6 g/L K2SO4，14.9 g/L MgSO4·7H2O，4.13 g/L KOH，26.7 mL/L H3PO4，0.93 g/L CaSO4，4.35 mL/L微量元素溶液 (6 g/L CuSO4·5H2O，0.09 g/L KI，3g/L MnSO4·H2O，0.02g/L H3BO3，0.24 g/L MoNa2O4·2H2O，0.5 g/L CoCl2，20 g/L ZnCl2，65 g/L FeSO4·H2O，0.2 g/L 生物素，5.0 mL/L H2SO4)。微量元素在应用前经过直径为0.22 μm的膜过滤除菌。在发酵过程中，毕赤酵母的培养条件为pH 5.0，500 r/min，30℃。毕赤酵母的发酵过程如下:毕赤酵母首先在BSM培养基中生长16～20 h。接着流加50%甘油(含有12 ml/L微量元素溶液)直到细胞浓度达到110 g DCW/L(干细胞重，约30 h)。然后等待0.5～2 h使毕赤酵母消耗完培养液中的残余甘油。最后流加甲醇(含有12 mL/L微量元素溶液)诱导毕赤酵母高效表达SAM合成酶［16］。在流加甲醇诱导2 h后加入10 g/L甲硫氨酸使毕赤酵母细胞积累SAM。

1.2.2 细胞破碎

离心(6 000 r/min，3 min)收集细胞后，以去离子水洗涤细胞2次。本研究中采用3种方法破碎细胞:1.0 kg湿细胞与4 L 1 mol/L高氯酸在4℃下混合2 h;1.0 kg湿细胞与4 L 1 mol/L乙酸乙酯和1 mol/L硫酸(1 mol/L)在4℃下混合2 h;1.0 kg湿细胞与4 L 1 mol/L硫酸在4℃下混合2 h。然后离心收集上清(6 000 r/min，10 min)。发酵液和等体积20%高氯酸混匀后冷却至4℃，放置8 h以上，离心(12 000 r/min)3 min，经0.22 μm膜过滤，上清液中SAM含量作为细胞中绝对SAM含量。

1.2.3 树脂的静态筛选

首先，10 g大孔树脂(表1)与50 mL SAM溶液在100 r/min，0℃混合吸附SAM。利用过滤的方式回收树脂。树脂与50 mL 1mol/L硫酸在100 r/min，0℃下解析SAM。操作期间提取SAM溶液，测定吸附和解析的效果。

表1 本研究中采用的4种树脂Table 1 Four types of resin used in this study

1.2.4 静态条件下SAM浓度与pH对吸附的影响

10 g D151分别与50 mL质量浓度为5.0、7.5、10.0、12.5、15.0 g/L 的 SAM 溶液在100 r/min，0 ℃混合2 h。利用氨水调节pH值分别为1.5、2.5、3.5、4.5、5.5。SAM 吸附率计算:

式中，C0:初始 SAM质量浓度，g/L;C:吸附后SAM质量浓度，g/L。

1.2.5 静态条件下硫酸溶液浓度对SAM解吸的影响

吸附SAM后的10 g D151树脂经过分离后在pH4.5，100 r/min下分别与 50 mL 浓度为 5、10、20、50、100、200、500、1 000 mmol/L 的硫酸溶液混合1 h。

1.2.6 SAM溶液的流速对SAM吸附的影响以及硫酸对SAM解吸的影响

SAM 溶液 (7.71 g/L，pH 4.5)分别以 0.1、0.2、0.5、1.0 mL/min的流速流过D151柱 (8 cm×2 cm)。然后以2倍柱体积去离子水洗涤。用0.1 mol/L的硫酸分别以 0.1、0.2、0.5、1.0 mL/min洗脱。每 5 min收集洗脱液进行分析。

1.2.7 SAM分析

采用高效液相色谱法(Waters 1525，2487，Milford，United States)。SAM样品经过直径为0.22 μm的膜过滤后进行分析。液相色谱柱为Hypersail SCX column(4.6mm ×250 mm，5 μm)。流动相为 0.5 mol/L甲酸铵溶液(pH4.0)。

2 结果和分析

2.1 不同细胞破碎方法对SAM释放的影响

本研究参考了文献中机械冲压、超声等方法后采用化学溶剂法破碎细胞。这是由于化学法破碎细胞成本低，容易放大操作规模。在1 mol/L高氯酸、1 mol/L乙酸乙酯和1 mol/L硫酸、1 mol/L硫酸破碎溶液中 SAM的释放率分别为 96.22%、94.02%、75.00%(表2)。相比硫酸，高氯酸属于强氧化剂，考虑到化学溶剂对环境的危害，所以尽量减少高氯酸的使用。在1 mol/L硫酸中SAM的释放量较低(75.00%)，所以1 mol/L乙酸乙酯和1 mol/L硫酸的混合溶液作为破碎细胞的溶液。在乙酸乙酯和硫酸的混合溶液破碎细胞过程过程中，乙酸乙酯可以溶解细胞壁的脂层导致细胞的破碎，硫酸可以将细胞膜水解完全，最后导致较高的破碎率。而且SAM在酸性环境下比较稳定。

表2 不同化学试剂破碎细胞的SAM释放率Table 2 SAM released ratios by different chemicals

2.2 树脂的静态筛选

图1是50 mL 7.71 g/L SAM溶液分别与4种树脂混合时溶液中SAM浓度的变化。4种不同树脂都可以很好地吸附SAM，最后溶液中SAM浓度都降低为0.5 g/L。但是SAM浓度的降低速率从快到慢依次为JK110、D151、HD-1、DK110。强酸性树脂(JK110)比弱酸性树脂(DK110)对SAM的吸附速度快。DK110需要60 min达到SAM浓度的吸附平衡。而其他3种树脂需要30～35 min达到吸附平衡。D151与JK110具有相似的吸附曲线，说明具有相似的吸附能力。

图1 静态条件下不同树脂对SAM的吸附曲线Fig.1 SAM absorption by different resins at different times

利用1 mol/L硫酸分别洗脱4种吸附SAM后的树脂的结果见图2。JK110释放SAM的速度最慢。HD-1释放SAM的速率比较稳定，比DK110和D151慢。DK110和D151释放SAM的速率相近。结合图1，D151对SAM的交换容量最大，所以本研究中选择D151作为分析SAM的树脂材料。

图2 静态条件下硫酸溶液洗脱不同树脂上SAM的曲线Fig.2 SAM deabsorption from different resins in sulfuric acid solution

2.3 SAM质量浓度和pH对D151吸附SAM的影响

SAM溶液的质量浓度由5.00 g/L提高到15.00 g/L，D151对SAM的吸附量也逐渐增加 (表3)。可是，SAM的吸附率由95.00%降低到55.73%。考虑到初始SAM的浓度和吸附率，本研究中采用SAM溶液的质量浓度为7.50 g/L。

表3 SAM浓度对D151吸附SAM的影响Table 3 Effects of SAM concentrations on SAM absorption to D151

由于SAM分子上具有丰富的离子基团(图3)，选用离子交换法是分离SAM的主要手段。SAM分子中腺苷上氨基的等电点为pH3.4，核糖上羟基的等电点为pH12.5，L-甲硫氨酸上氨基和羧基的等电点分别为pH7.8和pH1.8。可见，在任何pH值下SAM分子都有基团处于离子化的状态。由于SAM在碱性环境中不稳定，所以SAM的纯化过程要保持酸性环境。由于D151是弱酸性阳离子交换树脂(表1)，SAM的吸附量和吸附率在pH由2.5升高为6.5时也升高(表 4)。SAM吸附率由14.94% 提高到96.23%。SAM吸附率在pH4.5时为92.95%。pH继续升高时SAM吸附率升高不明显。D151在pH4.5吸附SAM量为36.95 mg SAM/g树脂。

图3 SAM的分子结构Fig.3 Molecular structure of SAM

表4 pH对D151吸附SAM的影响Table 4 Effect of pH on SAM absorption to D151

2.4 硫酸浓度对SAM洗脱的影响

硫酸溶液作为洗脱液在浓度升高时，SAM的洗脱率逐渐升高(图4)。图4中SAM的洗脱率可以分为3个阶段:硫酸浓度在20 mmol/L以下，SAM的洗脱率升高缓慢;硫酸浓度在20 mmol/L和100 mmol/L之间SAM的洗脱率快速升高;硫酸浓度高于100 mmol/L后SAM的洗脱率升高平缓。

图4 不同浓度硫酸对洗脱SAM的影响Fig.4 SAM released ratio from D151 by different sulfuric acid concentrations

2.5 SAM溶液的流速对SAM吸附的影响

SAM溶液的流速对D151吸附SAM的结果见图5。本研究以吸附90%作为基本要求。在SAM溶液流速分别为 0.1、0.2、0.5、1.0 mL/min 时 D151 吸附90%SAM 所需要的时间分别为 1150、360、200、70 min。本研究采用0.2 mL/min流速的SAM溶液，吸附率为92.00%。

图5 SAM溶液的流速对D151吸附SAM的影响Fig.5 Effect of SAM solution flow rate on SAM absorption to D151

2.6 硫酸溶液的洗涤流速对洗脱SAM的影响

表5是硫酸溶液洗脱的流速对SAM洗脱的影响。SAM的洗脱率随着硫酸溶液的流速逐渐增加而先升高而后降低。在硫酸溶液的流速为0.2 mL/min时SAM的洗脱率为最高(92.52%)。SAM的溶液经过高效液相色谱测定后纯度为92%(图6)。

3 结论

本研究报道了一个完整的SAM的纯化工艺的优化过程。在这个纯化工艺中，首先采用化学试剂法破碎细胞得到94.02%的SAM释放率。然后经过离子交换树脂纯化SAM(92.00%吸附率，92.52%洗脱率)的纯度为92%。本工艺中SAM的最终回收率达到80.03%。

图6 分离后SAM溶液的高效液相色谱分析图Fig.6 SAM analysis by HPLC

［1］ LU S C.S-Adenosylmethionine［J］.The International Journal of Biochemistry＆ Cell Biology，2000，32(4):391－395.

［2］ Mato J M，Alvarez L，Ortiz P，et al.S-adenosylmethionine synthesis:Molecular mechanisms and clinical implications［J］.Pharmacology ＆ Therapeutics，1997，73(3):265 －280.

［3］ Schlenk F，Dainko J L，Stanford S M.Improved procedure for the isolation of S-adenosylmethionine and S-adenosylethionine［J］.Archives of Biochemistry and Biophysics，1959，83(1):28 －34.

［4］ Shiozaki S，Shimizu S，Yamada H.Production of S-adenosyl-l-methionine by Saccharomyces sake［J］.Journal of Biotechnology，1986，4(6):345 －354.

［5］ Choi E S，Park B S，Lee S W，et al.Increased production of S-adenosyl-L-methionine using recombinant Saccharomyces cerevisiae sake K6［J］.Korean Journal of Chemical Engineering，2009，26(1):156 －159.

［6］ WANG Y，WANG D，WEI G，et al.Improved co-production of S-adenosylmethionine and glutathione using citrate as an auxiliary energy substrate［J］.Bioresource Technology，2013，131:28－32.

［7］ Mincheva K，Kamburova V，Balutzov V.Production of S-adenosyl-L-methionine by a mutant strain of Kluyveromyces lactis［J］.Biotechnology Letters，2002，24(12):985 － 988.

［8］ Mincheva K，Kamburova V，Balutzov V.Optimization of S-adenosyl-L-methionine production by Kluyveromyces lactis on whey in batch culture using a mathematical model［J］.Biotechnology Letters，2002，24(21):1 773 －1 777.

［9］ Detchanamurthy S，Shanmugam K，Parkunan S M A，et al.Cloning and expression of S-Adenosyl Methionine Synthetase gene in recombinant E.coli strain for large scale production of SAMe［J］.Electronic Journal of Biotechnology，2010，13(4):1 －2.

［10］ Shobayashi M，Mukai N，Iwashita K，et al.A new method for isolation of S-adenosylmethionine(SAM)-accumulating yeast［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，2006，69(6):704－710.

［11］ LI W，YE S，LUO K，et al.Isolation and characterisation of Candida sp.mutants enriched in S-adenosylmethionine(SAM)［J］.Annals of Microbiology，2007，57(3):383 －387.

［12］ CAO X，YANG M，XIA Y，et al.Strain improvement for enhanced production of S-adenosyl-L-methionine in Saccharomyces cerevisiae based on ethionine-resistance and SAM synthetase activity［J］.Annals of Microbiology，2012，62(4):1 395 －1 402.

［13］ HUANG Y，GOU X，HU H，et al.Enhanced S‐ adenosyl‐l‐methionine production in Saccharomyces cerevisiae by spaceflight culture，overexpressing methionine adenosyltransferase and optimizing cultivation［J］.Journal of Applied Microbiology，2012，112(4):683 －694.

［14］ LI D Y，YU J，TIAN L，et al.Production of SAM by recombinant Pichia pastoris［J］.Chinese Journal of Biotechnology，2002，18(3):295 －299.

［15］ Cregg J M.Introduction:distinctions between Pichia pastoris and other expression systems［J］.Methods in Molecular Biology(Clifton，NJ)，2006，389:1 －10.

［16］ ZHANG J，WANG X，SU E，et al.A new fermentation strategy for S-adenosylmethionine production in recombinant Pichia pastoris［J］.Biochemical Engineering Journal，2008，41(1):74 －78.

［17］ ZHANG J，WANG X，ZHENG Y，et al.Enhancing yield of S-adenosylmethionine in Pichia pastoris by controllingconcentration［J］.Bioprocess and Biosystems Engineering，2008，31(2):63 －67.

［18］ ZHANG J G，WANG X D，ZHANG J N，et al.Oxygen vectors used for S-adenosylmethionine production in recombinant Pichia pastoris with sorbitol as supplemental carbon source［J］.Journal of Bioscience and Bioengineering，2008，105(4):335 －340.

［19］ Morana A，Di Lernia I，Cartenì M，et al.Synthesis and characterisation of a new class of stable S-adenosyl-l-methionine salts［J］.International Journal of Pharmaceutics，2000，194(1):61 －68.

［20］ SHEN L，LI D，JIANG G Y，et al.Stability and stable salts of S-adenosylmet hionine［J］.Pharm Biotechnol，2003，10(2):125－128.

［21］ LIU H，WU J，LIN J，et al.Purification of S-adenosyl-L-methionine and preparation of its stable salt products［J］.Chinese Journal of Biochemical Pharmaceutics，2002，23(6):284－287.