乳酸片球菌素Ped-A基因表达载体的构建

穆熙军，刘秀侠，许燕侠，孙学森，谷　巍（山东宝来利来生物工程股份有限公司，山东泰安　271000）



乳酸片球菌素Ped-A基因表达载体的构建

穆熙军，刘秀侠，许燕侠，孙学森，谷巍
（山东宝来利来生物工程股份有限公司，山东泰安271000）

摘要：乳酸片球菌素可以作为防腐剂延长食品的保鲜期，为研究和开发可食用级别的防腐剂，将乳酸片球菌素结构基因Ped-A全长和不含信号肽的序列克隆至乳酸菌表达载体pMG36e和pNZ8048，经酶切鉴定及序列分析，所转化的大肠杆菌DH5α和DHB4中含有插入Ped-A基因全长和不含信号肽的序列的重组质粒。结果表明，成功构建了乳酸片球菌素Ped-A基因的乳酸菌表达载体pMG36e/Ped-A（全长/片段）、pNZ8048/Ped-A（全长/片段）。

关键词：乳酸片球菌素Ped-A；乳酸菌表达载体；构建

抗生素作为饲料添加剂添加到畜禽日粮中能够促进动物生长、提高饲料转化率及防治疾病等，但饲用抗生素的负面影响受到越来越多的关注，例如耐药性、残留甚至可能危害到人类健康。益生素、酶制剂、酸化剂、抗菌肽等抗生素替代品成为当今学者的研究热点。抗菌肽来源于生物体本身，具有相对分子质量小、性能稳定及较强的广谱抗菌能力等特点，其作为饲料添加剂应用于饲料中具有明显的优势[1]。片球菌、链球菌、乳杆菌等属的菌株在代谢过程中可以合成并分泌到环境中对致病菌以及腐败菌具有抑制作用的杀菌蛋白或多肽，即乳酸菌素[2]。链球菌产生的乳链菌肽对革兰氏阳性菌有抗性，因其理化性质稳定且无毒副作用，作为食品添加剂获得FAO/WHO食品添加剂联合委员会的认可[3]。与用于工业生产的乳链菌肽相比，乳酸片球菌来源的乳酸片球菌素对革兰氏阳性菌也有抑菌活性，能有效杀死病原菌，尤其能抑制单核细胞增多症李氏杆菌的生长[4]。韩烨等将乳酸片球菌素Ped-A基因克隆到pET-28a中，经诱导在大肠杆菌中表达，表达产物对单核细胞增多症李氏杆菌有抗菌作用[5]。目前，已经开发出商品化的乳酸片球菌素Ped-A，可延长食品的保鲜期，并且能显著抑制肉制品中李氏杆菌的生长[6]。随着世界人口的剧增，减少粮食损失与浪费是提高全球粮食安全与实现环境可持续发展的一个重要体现。利用生物防腐剂和生物防治技术可以延长食品、饮料或饲料的贮藏时间和安全性，并且不改变其感官特性[7]。本文将乳酸片球菌素Ped-A基因克隆到乳酸菌表达载体，对今后利用重组乳酸菌表达、纯化乳酸片球菌素，从而为获得具有抑菌活性的乳酸片球菌素提供了参考依据，为乳酸片球菌素作为防腐剂的开发奠定理论和技术基础。

1　材料和方法

1.1试验材料

大肠杆菌DH5α为TaKaRa公司产品，大肠杆菌DHB4为山东农业大学王晓云教授惠赠；pMG36e和pNZ8048为山东宝来利来生物工程股份有限公司研究院基因工程研究室保存；dNTP、EasyTaq DNA聚合酶、EasyPfu DNA聚合酶购自北京全式金生物技术有限公司；T4DNA连接酶、限制性内切酶XbaⅠ和HindⅢ购自TaKaRa公司；DL2000 DNA Mark⁃er、DL5000 DNA Marker、DNA凝胶回收试剂盒购自TaKaRa公司；质粒小量快速提取试剂盒购自OMEGA公司；其他试剂均为国产分析纯试剂。

1.2试验方法

1.2.1 Ped-A基因合成

根据NCBI公布的基因序列，将乳酸片球菌素Ped-A基因全长（189 bp）及不含信号肽的序列（135 bp）上下游分别添加XbaⅠ和HindⅢ酶切位点，委托TaKaRa公司合成，同时根据目的基因序列设计引物PED1、PED2、PED3，引物PED1/PED3对应于全长基因，引物PED2/ PED3对应于不含信号肽的序列。根据载体pMG36e、pNZ8048序列分别设计引物PMG1/ PMG2、PNZ1/ PNZ2，各引物序列见表1，均由济南博尚公司合成。

表1　引物序列

将TaKaRa合成产物pMD18-T/Ped-A（全长/片段）活化培养后收集菌液，提取质粒，使用XbaⅠ和HindⅢ分别进行单酶切、双酶初步鉴定。DNA序列分析由济南博尚公司完成（使用pMD18-T载体通用测序引物），使用DNAMAN软件将测序结果与理论序列比对。

1.2.2重组质粒pMG36e/Ped-A（全长/片段）和pNZ8048/Ped-A（全长/片段）的构建

1.2.2.1酶切、连接和转化

提取pMD18-T/Ped-A（全长/片段）、pMG36e和pNZ8048质粒，均用XbaⅠ和HindⅢ双酶切，胶回收后，16℃连接过夜。连接产物pMG36e/Ped-A（全长/片段）和pNZ8048/Ped-A（全长/片段）分别转化DH5α和DHB4感受态细胞，加连接产物5 μL与感受态细胞50 μL混合，冰浴30 min，42℃热激60 s，加LB培养基900 μL，37℃振荡培养1 h，8 000 rpm离心收集菌体2 min，弃部分上清，悬浮菌体，取全部菌液涂LB平板（分别添加红霉素200 μg·mL-1和氯霉素7.5 μg·mL-1）。

1.2.2.2阳性克隆的筛选

菌液PCR筛选pMG36e/Ped-A（全长/片段）阳性克隆，所用引物为载体引物PMG1/PMG2。PCR条件为94℃，5 min；94℃，30 s；55℃，30 s；72℃，1 min 20 s（扩增30个循环）；72℃，6 min。

菌液PCR筛选pNZ8048/Ped-A（全长/片段）阳性克隆，所用引物为载体引物PNZ1/ PNZ2。PCR条件为94℃，5 min；94℃，30 s；56℃，30 s；72℃，1 min 40 s（扩增30个循环）；72℃，5 min。

扩增产物用1% TAE琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.2.3重组质粒的酶切鉴定及DNA序列分析

选取筛选出的阳性重组菌扩大培养，提取质粒，使用XbaⅠ和HindⅢ酶切初步鉴定重组子。将提取出的重组质粒pMG36e/Ped-A（全长/片段）和pNZ8048/Ped-A（全长/片段）送济南博尚公司测序。

2　结果与分析

2.1 pMD18-T/Ped-A（全长/片段）酶切鉴定及测序

pMD18-T/Ped-A（全长/片段）XbaⅠ和HindⅢ酶切鉴定电泳图见图1，PMD18-T/Ped-A（全长/片段）XbaⅠ和HindⅢ双切酶鉴定电泳图见图2。

将TaKaRa合成产物活化培养后收集菌液，提取质粒，使用XbaⅠ和HindⅢ分别进行单酶切及双酶切验证，结果见图1、2。单酶切后所得片段的大小约3 kb，与理论值一致；双酶切结果中，目的基因条带大小合适。将TaKaRa公司合成产物pMD18-T/Ped-A（全长/片段）送济南博尚公司测序（使用pMD18-T载体通用测序引物），测序结果显示，合成的序列完全正确。

图1　 pMD18-T/Ped-A（全长/片段）XbaⅠ和HindⅢ酶切鉴定电泳图

2.2重组质粒pMD18-T/Ped-A（全长/片段）阳性克隆的菌液PCR筛选结果

pMG36e/Ped-A（全长/片段）菌液PCR（引物PMG1/PMG2）筛选电泳图见图3。

使用T4DNA连接酶将回收的目的基因与载体片段进行连接，连接产物转化DH5α。使用载体引物PMG1/PMG2进行菌液PCR筛选阳性克隆，产物用1% TAE琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图3，所得目的条带大小正确，筛选到多个阳性克隆。

图2　 pMD18-T/Ped-A（全长/片段）XbaⅠ和HindⅢ双酶切鉴定电泳图

图3　 pMG36e/Ped-A（全长/片段）菌液PCR（引物PMG1/PMG2）筛选电泳图

2.3重组质粒pMG36e/Ped-A（全长/片段）的酶切鉴定及测序

pMG36e/Ped-A（全长/片段）重组质粒电泳图见图4。

图4　 pMG36e/Ped-A（全长/片段）重组质粒电泳图

使用OMEGA质粒提取试剂盒提取质粒，电泳检测，质粒大小正确，见图4；37℃条件下使用XbaⅠ和HindⅢ双酶切3 h后电泳检测，在相应位置出现条带，表明pMG36e/Ped-A（全长/片段）构建成功，结果见图5。将重组质粒送济南博尚公司测序，对测序结果进行比对，证实表达载体pMG36e/ Ped-A（全长/片段）构建成功。

2.4重组质粒pMG36e/Ped-A（全长/片段）阳性克隆的菌液PCR筛选结果

pNZ8048/Ped-A（全长）菌液PCR筛选电泳图见图6。pNZ8048/Ped-A（片段）菌液PCR筛选电泳图见图7。

使用T4DNA Ligase将回收的目的基因与载体片段进行连接，连接产物转化DHB4，使用载体引物PNZ1/PNZ2进行菌液PCR筛选，扩增产物用1% TAE琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图6、7，由图可以看出，成功筛选到多个阳性转化子。

2.5重组质粒pNZ8048/Ped-A（全长/片段）酶切鉴定

重组质粒pNZ8048/Ped-A（全长/片段）电泳图见图8。重组质粒pNZ8048/Ped-A（全长/片段）酶切鉴定电泳图见图9。

使用OMEGA质粒提取试剂盒提取质粒，电泳检测，如图8所示；37℃条件下使用XbaⅠ和HindⅢ双酶切3.5 h后电泳检测，结果见图9。将提取出的重组质粒送济南博尚公司测序，测序结果证实表达载体pNZ8048/Ped-A（全长/片段）构建成功。

图5　 pMG36e/Ped-A（全长/片段）重组质粒电泳图

图6　 pNZ8048/Ped-A全长的菌液PCR筛选电泳图

图7　 pNZ8048/Ped-A（片段）菌液PCR筛选电泳图

图8　重组质粒pNZ8048/Ped-A（全长/片段）电泳图

图9　重组质粒pNZ8048/Ped-A（全长/片段）酶切鉴定电泳图

3　讨论

在食物及饲料保存中，传统的化学防腐剂可以解决由微生物引起的腐败和疾病，但防腐剂的滥用又造成了一系列的安全问题。乳酸片球菌素具有天然安全、无毒副作用及耐热耐酸的特性，因而作为可食用级别防腐剂具有良好的应用前景[8]。野生乳酸片球菌素产量低、分离纯化技术不成熟，纯化产物得率和纯度不能两全，这些问题是乳酸片球菌素实现规模化生产和应用的瓶颈[9]。近些年大量研究尝试利用蛋白质工程、基因工程方法获得更高活性的细菌素[10]。异源表达可以提高乳酸片球菌素的产量，目前多用大肠杆菌表达系统、酵母菌表达系统和乳酸菌表达系统表达片球菌素[11-12]。虽然以大肠杆菌为宿主可以实现乳酸片球菌素的高效表达和具有易于纯化的特点，但将其表达的乳酸片球菌素作为食品级防腐剂获得许可并推广应用存在争议。乳酸菌是人和动物肠道内的常见细菌，因其不具有致病性，被公认为安全级微生物，并且在青贮饲料发酵中起主要作用，是一类数量和种类最多的微生物。因此，利用乳酸菌作为片球菌素异源高效表达的宿主表达菌成为具有前景的选择。

4　结论

本研究将Ped-A基因成功克隆到乳酸菌表达载体pNZ8048和pMG36e，积累了乳酸菌表达载体的构建，为食品级乳酸菌高效表达系统的开发利用打下坚实的基础。

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Construction of Expression Vectors for Lactic Acid Pediocin Ped-A

MU Xijun, LIU Xiuxia, XU Yanxia, SUN Xuesen, GU Wei
（Shandong Baolai-Leelai Bio-Industrial Co., Ltd., Taian 271000, Shandong China）

Abstract:Lactic acid pediocin can be used as a preservative to extend the shelf life of food. The full gene se⁃quence of Ped-Aand without signal peptide were inserted into expression vectors pMG36e and pNZ8048. By using re⁃striction enzyme and sequence analysis, it can be proved that recombinant plasmids pMG36e/Ped-A(full length/ frag⁃ment) and pNZ8048/Ped-A(full length / fragment) were transformed into E. coli DH5α and DHB4 successfully. The result confirmed that Ped-Agene expressionvectors were constructed successfully.

Key words:pediocin Ped-Agene; lactobacillus expression vector; construction

作者简介：穆熙军（1982-），男，山东泰安人，硕士，助理研究员，主要从事基因工程技术在微生态制剂应用的研究。

收稿日期：2014-10-05

中图分类号：TS201.3

文献标志码：A

文章编号：1001-0084（2015）02-0001-05