糖尿病肾病患者蛋白尿中C3a致肾小管上皮细胞转分化

陈忠锋，夏楠楠，何 兵

(郑州大学附属郑州中心医院，河南 郑州450000)

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)已经成为导致终末期肾脏病(end-stage renal disease，ESRD)主要病因之一。肾小管间质纤维化是DN 进展过程中起决定作用的组织学改变，关键环节就是肾小管上皮细胞发生上皮-间充质细胞转分化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)。研究表明补体C3 裂解产物C3a 可能是蛋白尿造成肾小管间质纤维化的因素之一。因此，本实验应用糖尿病肾病患者蛋白尿及C3a 受体拮抗剂离体培养人肾小管上皮细胞(human renal tubular epithelial cells，hRTECs)，观察其转分化情况及其相关指标变化。

1 材料与方法

1.1 主要材料:选用hRTECs 为研究对象。兔抗人GAPDH 单克隆抗体、兔抗人α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和兔抗人E 钙黏蛋白(E-cadherin)多克隆抗体(Abcam 公司)，兔抗C3aR 多克隆抗体(Santa Cruz 公司)。C3aELISA 试剂盒(上海生工公司)。C3a 受体拮抗剂SB290157(Calbiochem 公司)。

1.2 方法

1.2.1 尿蛋白提取与鉴定:选取确诊为糖尿病肾病Ⅳ期30例患者的清洁中段尿液。沉淀浓缩尿蛋白，超滤灭菌。BCA法检测蛋白浓度。进行蛋白质量验证，排除细菌和尿液混入，－70℃保存。

1.2.2 细胞培养及分组:hRTECs 培养于含10%牛胎血清DMEM 培养基中，实验前用无血清培养基培养12 h 进行基同步化处理，后更换为条件培养基依次分组为:1)按不同尿蛋白浓度:对照组、1.0、3.0 和8.0 mg/mL 组;2)按不同处理培养基:对照组、尿蛋白浓度8.0 mg/mL、尿蛋白浓度8.0 mg/mL+SB290157 组。

1.2.3 检测相关指标:Western blot检测各组E-cadherin、α-SMA、C3aR 蛋白表达情况，Image J 软件分析目的条带吸光度值。相差显微镜观察各组细胞形态变化。按ELISA 试剂盒操作，检测各组上清液C3a浓度。

1.3 统计学分析:应用SPSS17.0 统计软件分析，实验数据以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用单因素方差分析，LSD 法进行两两比较。

2 结果

2.1 不同浓度尿蛋白培养hRTECs，检测表型标记蛋白及C3aR 变化(图1)。

图1 不同浓度尿蛋白培养hRTECs 细胞的表型标记蛋白和C3aR 变化Fig1 Changes of phenotypic marker protein and C3aR in cultured hRTECs treated with different concentrations of urinary protein

2.2 ELISA法检测各组细胞上清液中C3a浓度(图2)。

图2 ELISA法检测用不同浓度蛋白尿培养的细胞上清液中C3a浓度Fig2 Using ELISA to analyse C3a in cell culture supernatant of different concentrations proteinuria (±s，n=3)

2.3 不同处理条件培养基培养hRTECs，检测表型标记蛋白变化(图3)。

图3 不同处理条件培养基hRTECs 细胞表型标记蛋白变化Fig3 Phenotype marker protein changes in different treatments media of hRTECs

3 讨论

DN是导致ESRD的主要病因之一。慢性肾脏疾病进展至后期的组织学改变是肾小管间质纤维化，而其纤维化的关键环节就是发生EMT。

C3a具有趋化激活白细胞、介导炎性反应的作用。C3aR为C3a 受体，它不仅存在于噬中性粒细胞和单核细胞表面，也存在于肾脏细胞表面。研究认为小球滤过或小管腔内活化的补体成分是蛋白尿肾病中导致小管间质损伤主要因素之一[1]。糖尿病db/db小鼠的近曲小管和足细胞的C3aR高表达，推测糖尿病肾病可能与补体激活有关[2]。

本实验发现，用糖尿病肾病Ⅳ期患者的尿蛋白离体培养hRTECs，其发生了转分化，E-cadherin表达量下调，α-SMA、C3aR表达量上调，细胞上清液C3a 水平也升高，表明尿蛋白可致hRTECs 发生EMT，而这一过程可能与尿蛋白中C3a的水平升高，C3aR表达上调有关。这与报道[3]用C3a 刺激人肾小管上皮细胞发现C3a 参与诱导其转分化的结论相一致。当应用了C3aR 特异性拮抗剂SB290157，发现SB290157 组hRTECs 转分化减轻。这一结果表明在糖尿病肾病患者尿蛋白中C3a 参与导致hRTECs 转分化，抑制C3aR 可以使其转分化减轻。

通过研究发现补体C3a及其受体在糖尿病肾病肾小管转分化的过程中起着十分重要的作用。因此抑制补体的激活可能成为减轻糖尿病肾病间质纤维化，延缓其进展的新治疗靶点。

[1]郑敬民，朱小东，张明超，等.高表达C3aR的肥大细胞在糖尿病肾病患者肾组织中的分布及病理意义分析[J].生物化学与生物物理进展，2011，38:262-268.

[2]Zheng JM，Zhu XD，Zhang MC，et al.Expression and possible role of C3aR in the kidney of Diabetic db/db mice[J].Prog Biochem Biophys，2010，37:847-854.

[3]Tang Z，Lu B，Hatch E，et al.C3a mediates epithelial-tomesenchymal transition in proteinuric nephropathy[J].Am Soc Nephrol，2009，20:593-603.