脂多糖诱导的急性肾损伤小鼠模型肾脏中JNK信号通路的激活

覃春美，刘 琦，李 莹，甘林望，刘 建，欧三桃

(泸州医学院 附属医院 肾病内科，四川 泸州646000)

急性肾损伤(acute kidney injury，AKI)是临床常见的危急重症，其发病率逐年上升，是导致患者死亡的重要原因。由内毒素脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)所导致的脓毒症是引起AKI的常见病因[1]。c-Jun 氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinases，JNK)信号通路作为促分裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)信号通路的重要通路之一，参与了细胞增殖与分化、细胞骨架构建、细胞凋亡和细胞恶变等多种生物学反应。既往研究发现多种肾脏疾病如梗阻性肾病、缺血性肾病、高血压肾病及糖尿病肾病[2-5]等均存在JNK信号通路的激活。然而JNK信号通路在AKI 肾组织中的激活情况以及与AKI 等肾脏疾病关系的研究罕见报道。本研究采用LPS 诱导的AKI 小鼠模型，观察肾脏中JNK信号通路的动态变化，进一步了解JNK 通路激活在AKI 发病过程中的重要作用和可能涉及的机制，为临床防治脓毒血症所致的AKI 提供新的治疗靶点。

1 材料与方法

1.1 材料

SPF级雄性小鼠(C57B1/6J)48只，体质量25～30 g[泸州医学院实验动物中心，许可证号:SYXK(川2013-065)];LPS 和α-tubulin 抗体(Sigma 公司);兔抗小鼠p-JNK 多克隆抗体和兔抗小鼠p-c-Jun单克隆抗体(San Diego 公司);生物素化羊抗兔IgG(Carlsbad公司);即用型ABC 试剂盒(武汉博士德公司);肿瘤坏死因子α ELISA 试剂盒(R＆D Systems 公司);白细胞介素1β ELISA 试剂盒(Leinco 公司)。

1.2 方法

1.2.1 AKI 模型的制备:将小鼠随机分为对照组和AKI组，每组24只，AKI组按LPS 5 mg/kg 一次性腹腔注射给药。正常对照组腹腔注射等体积磷酸盐缓冲液(PBS)，腹腔注射前禁食，自由饮水。分别于给药后1、2、4 和30 h 处死小鼠，采血及取肾组织标本(每组各6 只)。左肾部分组织固定于4%中性多聚甲醛液，经脱水、透明和包埋，制成肾组织石蜡块，其余肾组织冻存于－80℃冰箱中备用。

1.2.2 肾功能及肾脏病理检测:用7600 全自动生化分析仪测定血尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)，采用酶联免疫吸附法(ELISA)测血清胱抑素C(Cys C)水平，肾组织经常规脱水，石蜡包埋切片，行HE染色镜下观察肾组织病理改变。

1.2.3 免疫组化观察p-JNK 和p-c-Jun蛋白表达:按照免疫组化试剂盒说明，采用ABC 法，石蜡切片脱蜡至水后，热修复抗原，山羊血清封闭非特异性抗原，依次滴加一抗、二抗、ABC 复合物，DAB 显色后脱水、透明、中性树胶封片。以出现棕黄色颗粒为阳性信号。

1.2.4 Western blot检测p-JNK 和p-c-Jun蛋白水平:每一样本称取肾组织50 mg，用Urea RIPA 裂解缓冲液匀浆肾组织，4℃12 000 r/min 离心15 min，取上清为样本，Bradford 方法测定蛋白浓度，每孔取40 μg 蛋白上样，10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离后，转移至硝酸纤维素膜上，浸入封闭液室温孵育60 min。加抗p-JNK 抗体(或抗p-c-Jun抗体)一抗4℃冰箱过夜，加入荧光标记的羊抗兔抗体37℃孵育1 h，用ECL 探测显影。以α-tubulin为内参照，用Image J 软件对吸光度值进行定量分析。

1.2.5 ELISA法检测血TNF-α 和IL-1β水平:按试剂盒说明书检测血TNF-α 和IL-1β水平，每份标本重复3次，取平均值。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 肾功能及肾脏病理检测

与对照组相比较，AKI组小鼠于注射LPS 2 h后BUN、Scr 和Cys C 即开始明显上升，在30 h时升高最明显(图1)。注射LPS后，AKI组肾组织2 h时可见肾小管轻度扩张，肾小管空泡样变，随着时间的延长，4 h时可见肾小管扩张更明显，部分肾小球肿胀，肾间质可见炎性反应细胞浸润;30 h时肾脏损伤进一步加重，偶可见部分肾小管上皮细胞凋亡、空泡样变，甚至坏死(图2)。

2.2 免疫组化结果

对照组肾组织中p-JNK 和p-c-Jun 在肾小球及肾小管有散在微量表达。AKI组小鼠肾组织中可见p-JNK 和p-c-Jun 在1 h时表达开始明显增加，阳性着色较深，胞质胞核呈大量棕黄色，主要分布于肾小球足细胞、近曲小管、远曲小管、集合管、肾血管等部位，随时间进展表达逐渐增强，以4 h表达最强，30 h时p-JNK 和p-c-Jun表达显著下调(图3)。

图1 不同时间点血清尿素氮、肌酐和胱抑素C水平Fig1 The level of BUN，Scr and Cys C at different time points(±s，n=6)

图2 小鼠肾脏苏木精-伊红染色组织形态学特点Fig2 Histomorphological characteristics of kidney sections of mice(×400)

图3 免疫组化检测不同时间点p-c-Jun的表达Fig3 Expression of p-c-Jun at different time points detected by IHC(×200)

2.3 Western blot

注射LPS 1 h后p-JNK蛋白含量显著升高，于4 h达峰值，以后逐渐下降，30 h时p-JNK蛋白水平明显下降(图4)。p-c-Jun 在LPS 作用1 h时已明显上调，4 h达峰值后逐渐下降，30 h时与对照组无差异(图5)。

图4 不同时间点p-JNK的表达Fig4 Protein expression of p-JNK at different time points

图5 不同时间点p-c-Jun的表达Fig5 Protein expression of p-c-Jun at different time points

2.4 血清TNF-α、IL-1β的检测结果

小鼠注射LPS后1 h 血清TNF-α、IL-1β水平均较对照组升高，4 h 达峰值后逐渐下降，且30 h时仍明显高于对照组(P＜0.01)(图6)。

图6 不同时间点血清TNF-α 和IL-1β的含量Fig6 The level of TNF-α and IL-1β at different time points(±s)

3 讨论

AKI是危重症患者预后的独立危险因素，而危重患者AKI 最常见的病因为脓毒症休克、心源性休克、创伤以及药物中毒[6]。近来一个临床研究报道，在ICU 病房中，50%的AKI 患者由脓毒症所致[7]。LPS是革兰阴性细菌外膜上的主要成分，可以启动炎性反应，导致内毒素血症甚至脓毒症休克和多器官功能障碍综合征。本研究发现腹腔注射LPS 可导致小鼠迅速出现肾功能不全及肾组织病理损伤，成功诱导小鼠内毒素性AKI 模型。

JNK 又叫应激激活蛋白激酶，是MAPK信号传导通路的重要通路之一，可被多种细胞应激如(氧化应激、炎性反应因子)等激活，被活化后可磷酸化核转录因子及其他蛋白激酶，调节相关基因的转录，进而参与细胞生长、发育和凋亡等多种病理生理过程[8]。既往研究表明，JNK信号通路激活与肾脏疾病关系密切。用H2O2刺激小鼠肾小球系膜细胞，可使p-JNK的表达上升，并使活性氧(reactive oxygen species，ROS)的生成增多，导致肾小球系膜细胞的损伤和凋亡[9];观察JNK 在单侧输尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction，UUO)模型大鼠中的表达情况，结果UUO 组p-JNK的表达明显高于对照组，认为梗阻性肾病中存在JNK信号通路的激活[2]。本研究用LPS 诱导内毒素性AKI，研究结果显示p-JNK和p-c-Jun 在正常小鼠肾脏组织中仅有极少量表达，而在AKI 模型中，p-JNK 及p-c-Jun 在肾小球、肾小管区域的表达明显升高，p-JNK 和p-c-Jun蛋白水平在注射LPS 1 h时已显著上调，于4 h达峰值后逐渐下降，30 h时接近正常水平。上述结果表明在AKI的极早期就存在JNK 通路的明显激活，p-JNK及p-c-Jun 在AKI 小鼠肾脏的变化与LPS的刺激有关。本研究还发现不但小鼠AKI 模型肾组织中p-JNK 和p-c-Jun 较正常对照组明显升高，血中TNF-α 和IL-1β水平也显著升高，且其动态变化与JNK的变化规律呈一致性，表明脓毒症时促炎细胞因子TNF-α 和IL-1β的升高与JNK的活化明显相关。既往研究也证实，JNK 和c-Jun的表达可影响炎性反应的发生发展，LPS 刺激巨噬细胞分泌TNF-α 和IL-1β 等促炎反应因子与p-JNK 和p-c-Jun的激活有密切关系[10]。以上资料充分提示JNK信号通路激活可诱发TNF-α 和IL-1β 等炎性反应因子的释放，继而介导AKI的发生发展。

总之，C57B1/6J 小鼠腹腔注射LPS 致内毒素性AKI 模型中存在JNK 通路的激活，且参与了AKI的发生发展，提示JNK信号通路激活在LPS 诱导的小鼠AKI 发病中起重要作用。JNK信号通路有望成为内毒素介导AKI的新的治疗靶点，了解其动态变化规律有利于选择最佳时机对其阻断和干预。

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