RGD-重组葡激酶-人α微球蛋白融合蛋白原核表达、纯化及鉴定

苟冶然，龙小滨，白 磊，何 泉，陈 检，张绍城，汪德强*，周建中*

(重庆医科大学1.附属第一医院 心内科;2.感染病性疾病分子生物实验室，重庆400000)

葡激酶(staphylokinase，SAK)作为临床溶栓治疗的一线用药，是由金黄色葡萄球菌溶原性噬菌体合成的一种蛋白质，不仅具有高效的纤溶活性和纤维蛋白专一性，且不会引起全身纤溶亢进[1]，免疫原性及血管开通后再梗塞是限制其临床使用的主要原因[2-3]。

研究发现利用基因融合构建的融合蛋白一般均保留所构成的酶分子各自的酶活性[4]，因此推测如果将重组葡激酶与人α微球蛋白(α1M)及RGD(Arg-Gly-Asp)序列进行融合，所得的融合蛋白RGD-rSAKα1M 不仅具有高效的溶栓活性，并且借助α1M的免疫保护作用[5]降低SAK的免疫原性，还可通过RGD的抗血小板聚集作用[6-7]来降低其溶栓后再梗塞率，从而有效地解决临床上应用SAK 所面临的两大关键问题。基于本课题组的前期工作[8-10]，本研究拟构建RGD-rSAK-α1M 重组蛋白表达质粒，在大肠杆菌中表达，纯化后鉴定其生物活性，为研发一种新型低免疫原性溶栓剂提供新的思路和方法。

1 材料与方法

1.1 材料

重组葡激酶(rSAK)、人α微球蛋白截短体(α1M)、RGD 短肽、大肠杆菌DH5α、BL21、质粒PEGX-6P-1 和3C蛋白酶(本实验室提供)。高保真rTaq 酶、dNTP、T4 DNA 连接酶、限制性内切酶SalⅠ、Not Ⅰ、DNA Marker、分子量蛋白Marker 和质粒纯化试剂盒(Takara 公司)。质粒提取试剂盒(Promega 公司)。纤溶酶原、凝血酶、尿激酶标准品和纤维蛋白原(中国食品药品检定院)。其它相关试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 重叠延伸PCR:在本实验室所构建的人α微球蛋白基因、重组葡激酶的基础上，设计重叠延伸引物，测序结果如表1所示。

rSAK的正反向引物分别为SAK-F 与重叠引物overlap-R，其中SAK-F 中加入了RGD 四肽序列(粗体部分)，SAK-F 下划线斜体字代表限制性内切酶Sal Ⅰ的酶切位点;α1M的正反向引物分别为重叠引物overlap-F 与α1M-R，其中重叠引物斜体部分的18个碱基序列与重组葡激酶C端的相应碱基序列同源，α1M-R 下划线斜体字代表的酶切位点为限制性内切酶Not Ⅰ，α1M-R 和SAK-F 反向互补。为了SAK 与α1M的功能结构域的折叠不互相影响，重叠延伸引物(overlap F 和overlap-R)引入了GSG 连接序列(linker sequence，波浪线部分)。用引物SAK-F和overlap-R 对重组葡激酶模版PCR扩增，同时采用重叠引物overlap F及α1M-R 对α1M 蛋白PCR扩增，实验条件均设定为:预变性(94℃，10 min)，变性(94℃，1 min)，退火(50℃，1 min)，延伸(72℃，55 s)，循环30次。上述两组PCR 产物胶回收方法见文献[11]，纯化胶回收产物后以1∶1 比例进行混合作为模版，将SAK-F 与α1M-R 作为正反向引物扩增PCR，反应条件同上。重叠延伸PCR 示意图如图1所示。

表1 重叠延伸PCR引物Table1 The primers of overlapping PCR

1.2.2 表达质粒的构建:将实验室构建并保存好的PEGX-6P-1 质粒同正确测序的重叠延伸PCR 产物在37℃水浴条件下同时进行Sal Ⅰ和Not Ⅰ双酶切3 h，使用T4DNA 连接酶将目的和载体基因在16℃金属浴中过夜连接。

1.2.3 克隆菌的转化:连接产物转化于大肠杆菌(E.coli)DH5α 感受态细胞中，接种于氨苄抗性LB平板上，放置于37℃温箱中过夜。

1.2.4 阳性转化菌种筛选及双酶切鉴定:从转化后的LB 平板上挑选多个单克隆菌，依次接种于LB 培养基中(5 mL 氨苄抗性)，放置于振荡培养箱中培养(37℃，200 r/min)至A600为0.2，取出将菌液作为模板进行PCR 反应。琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR扩增产物，从而筛选阳性单克隆菌。依照试剂盒说明书上的操作步骤，将阳性结果的菌液继续过夜培养至A600为0.8～1.0，取出提取质粒。将提取的质粒以Sal Ⅰ和Not Ⅰ进行双酶切(37℃，4 h)，琼脂糖凝胶电泳鉴定双酶切结果。酶切结果阳性的重组质粒送本实验室(重庆医科大学感染性疾病分子生物学实验室)测序中心测定核苷酸序列并与目的基因片段比对。

1.2.5 转化表达菌及诱导表达融合蛋白:根据双酶切鉴定结果选取阳性质粒转化大肠杆菌(E.coli)BL21，再接种于LB 平板上(氨苄抗性)，放置于37℃温箱中过夜孵育。从恒温箱中孵育后的LB 平板上挑选多个单克隆菌，依次接种于LB 培养基中(300 mL 氨苄抗性)，放置于振荡培养箱中培养(37℃，200 r/min)至A600值为0.4～0.6，加入IPTG(终浓度为0.2 mmol/L)后放入摇床于18℃低温诱导20 h。

图1 重组葡激酶和人α微球蛋白的重叠延伸PCRFig1 Overlapping PCR of recombinant SAK and α1M

1.2.6 His-GST 融合蛋白的酶切和目的融合蛋白的纯化:(4℃，4 000 r/min)离心15 min 收集菌体，加入PBS(0.1 mmol/L，pH 7.4)、NaCl(300 mmol/L)搅拌均匀，冰浴中超声破菌仪破菌至菌液清亮。破菌后(4℃，12 000 r/min)离心30 min 收集上清液，以7 滴/s低速过镍柱，留取穿透液。先采用10 柱体积PBS(0.1 mmol/L，pH 7.4)洗脱杂蛋白，然后用咪唑溶液(100 mmol/L)来洗脱含His-GST 标签的融合蛋白，结果用SDS-PAGE 蛋白电泳验证。重新挑菌诱导破菌离心取上清液过镍柱，以PBS(0.1 mmol/L，pH 7.4)10 柱体积洗脱杂蛋白，向镍柱中加入终浓度为1 g/L的3C蛋白酶(酶切缓冲液配比:150 mmol/L NaCl，50 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，1 mmol/L DTT，pH 7.0)放置于冰箱4℃酶切8～12 h，将收集的洗脱液用SDS-PAGE 电泳分析。洗脱液过DEAE柱，SDS-PAGE 蛋白电泳验证结果，超滤DEAE-葡聚糖凝胶所得到的所有含目的融合蛋白的洗脱液至1 mL。用分子筛(Superdex 75)继续纯化浓缩样品，洗脱曲线通过电脑记录，依次选取洗脱峰尖附近所对应的蛋白进行取样，结果通过SDS-PAGE 蛋白电泳验证。电泳完成后，用抗SAK 和抗α1M的抗体分别进行免疫印迹(Western blot)方法见文献[12]。验证后将相应的目的蛋白样品用等体积超滤缓冲液(5 mmol/L，pH 8.0 Tris-HCl，50 mmol/L NaCl)进行超滤浓缩至浓度为1 g/L，分装后置于－80℃保存。

1.2.7 融合蛋白的溶栓活性鉴定:用纤维平板溶圈法[9]。用尿激酶标准品活性的对数和溶圈直径的对数做一标准曲线，通过测量各蛋白样品融圈的横径和竖径，计算其融圈直径d =横径+竖径/2，将d带入建立的回归方程计算各种样品的溶栓活性。

1.2.8 抑制血小板聚集实验:取20mL 用枸橼酸钠(3.8%浓度，0.1 体积)处理过的新鲜人血液，用离心机以1 000 r/min 转速离心10 min，然后取离心后上清即富血小板血浆(PRP)，取300 μL 加入20 μL待测样品，放置于恒温箱中37℃，继而加入致聚剂ADP 使其终浓度为10 μmol/L，在490 nm 波长处采用血小板聚集仪测定透射率，依据光透射率的增加量来测算出血小板的聚集率。血小板聚集抑制率计算方法如下:li% = (PAGmblank-PAGmCi/PAGmblank)×100% (PAGmblank代表空白最大血小板聚集率，PAGmCi代表相应药物最大血小板聚集率)。

2 结果

2.1 融合蛋白的克隆

以本实验室保存的重组葡激酶rSAK、人α微球蛋白的表达载体为模版进行PCR扩增，凝胶回收后进行重叠延伸PCR，其产物电泳鉴定结果(图2)显示:同预期结果一致，出现了单一特异性条带在1 000 bp附近。

图2 融合蛋白的重叠延伸PCRFig2 overlapping PCR of fusion protein

2.2 构建表达质粒与测定序列

重组质粒双酶切结果可见载体片段与重叠延伸PCR 产物片段(1 000 bp)(图3)。重组质粒测序结果与目的基因片段对比显示:基因片段连接完全正确，未发生错位及突变。

图3 重组质粒双酶切鉴定Fig3 Restriction analysis of the recombinant plasmid

2.3 表达与纯化目的蛋白

超声破菌所得上清液的SDS-PAGE 结果显示，目的融合蛋白在大肠杆菌(E.coli)BL21 中大量表达，且以可溶性蛋白形式表达(图4，泳道2)。用目的蛋白洗脱液(20 mmol/L Tris-HCl，300 mmol/L NaCl，500 mmol/L 咪唑，pH 8.0)洗脱His-GST 标签的融合蛋白，仍然含有大量杂蛋白，以相对分子量(Mr)在26 000 处最明显(图4，泳道4)。以1 g/L的3C蛋白酶进行过夜酶切后，所得目的融合蛋白大小与预期一致，大约在相对分子量(Mr)36 000 处(图4，泳道5)。DEAE 层析柱进一步纯化，可见一明显的目的蛋白洗脱峰(图5)。收集相应洗脱液超滤浓缩后SDS-PAGE 验证(图4，泳道6)。分子筛(Superdex 75)进一步纯化，洗脱曲线如图6所示。SDS-PAGE 鉴定洗脱峰尖组分所含蛋白，纯化度达90%以上(图4，泳道7)。洗脱体积为67 mL，按计算公式:log WM= －0.015 4 Ve+5.586 06(Ve 为洗脱体积)计算，融合蛋白的表观分子量约为36 ku。电泳完成后，用抗SAK 和抗α1M的抗体分别进行免疫印迹(Western blot)验证，结果如图7所示，获纯度达90%以上的目的融合蛋白。

图4 融合蛋白的表达与纯度鉴定Fig4 Expression and purity identfication of the fusion protein

图5 DEAE 交换柱层析图Fig5 Chromatogram of DEAE ion exchange column

2.4 融合蛋白溶栓活性鉴定

纤维蛋白平板溶圈法鉴定结果如图8所示。重组葡激酶与尿激酶标准溶栓活性相当，且在rSAK中加入人α微球蛋白及RGD 短肽序列没有明显降低葡激酶的纤溶活性(表2)。

图6 分子筛柱层析图Fig6 Chromatogram of molecular sieve column

2.5 抗血小板聚集活性的测定

测定结果表明RGD-rSAK-α1M 与相应浓度的rSAK 相比，具有显著抑制ADP 激活血小板聚集的作用(P＜0.01)，与单独使用相应浓度的RGD 无明显差异(图9)，同时，表明其抗血小板聚集活性具有一定的剂量效应依赖关系。

图7 RGD-重组葡激酶-人α微球蛋白免疫印迹结果Fig7 Western blot result of RGD-recommbinat SAK-α1M

图8 目的蛋白纤溶活性效果图Fig8 Fibrinolytic activity of target protein

表2 目的蛋白比活性对比图Table2 The comparison of thrombolytic activity

图9 抗血小板聚集活性效果图Fig9 The anti-platelet aggregation activity(±s，n=3)

3 讨论

葡激酶(staphylokinase，SAK)是一种具有极大临床应用前景的新型溶栓制剂，与尿激酶(urokinase，UK)、内生组织型纤溶酶原激活剂(tissue plasminogen activator，tPA)相比，具有更高的纤溶活性和纤维蛋白专一性，溶栓后出血并发症少[13]。但作为一种葡萄球菌来源的异体蛋白，进入机体后诱发的免疫反应及溶栓后可能再次梗塞限制了其日常的预防和恢复治疗的应用。国内外许多个研究已通过定点突变、化学修饰及构建融合蛋白等方法，对SAK 进行结构改造研究，以期降低其免疫原性及溶栓后再梗率。

应用OptimumGeneTM基因优化技术优化SAK 基因序列，并采用重叠延伸PCR 技术，在远离SAK 活性位点的部位连接上α1M 基因片段，构建出新的融合蛋白表达质粒PEGX-6P-1-RGD-rSAK-α1M，在大肠杆菌BL21 上清液中表达。所表达的融合蛋白N端带有His-GST 标签蛋白，可被3C蛋白酶特异性地识别并裂解去除，最后通过DEAE 和分子筛(Superdex 75)纯化，使目的融合蛋白的纯度达90%以上，并经Western blot 验证。本实验曾尝试构建rSAKRGD-α1M 及rSAK-α1M-RGD 融合蛋白，结果均以包涵体形式表达，这可能是因为这两种融合表达有较大的疏水表面暴露，导致了融合蛋白质的寡聚化，进而形成包涵体。目前融合蛋白的构建已在蛋白分子结构改造中显示出一定的优势，大量研究证实，通过基因工程技术构建的新的融合蛋白，一般均保留有各组分酶分子各自的酶活性，这为葡激酶的改造提供了新的思路。通过纤维蛋白平板溶圈法测定目的融合蛋白的体外溶栓活性及血小板聚集仪测定其抗血小板聚集活性的结果证明，本研究构建的融合蛋白RGD-rSAK-α1M 保留了SAK的溶栓活性，且其抗血小板聚集作用较单纯重组葡激酶明显提高。下一步试验中将通过动物模型验证该融合蛋白是否能借助α1M的免疫保护机制来降低葡激酶的免疫原性，同时验证是否通过RGD 降低了葡激酶出血副反应及溶栓后再梗塞率。RGD-rSAK-α1M是一种新型SAK 融合蛋白，具有溶栓、抗栓双重功能，有望成为心脑血管疾病溶栓的第3代药物。

[1]刘超龙.重组葡激酶静脉溶栓疗法在老年急性心肌梗死治疗中的临床应用价值分析[J].中国当代医药，2012，19:187-189.

[2]Chen Y H，Song G，Jiang F，et al.Crystal structure of a staphylokinase:variant a model for reduced antigenicity[J].Eur J Biochem，2002，269:705-711.

[3]Ohman EM，Harrington RA，Cannon CP，et al.Intravenous thrombolysis in acute myocardial infarcion[J].Chest，2001，119:252-277

[4]Kotb E.The biotechnological potential of fibrinolytic enzymes in the dissolution of endogenous blood thrombi[J].Biotechnol Prog.2014 May;30(3):656-72.doi:10.1002/btpr.1918.Epub 2014 May 7.

[5]Grewal JS，Tsai JY，Khan SR，et al.Oxalate-inducible AMBP gene and its regulatory mechanism in renal tubular epithelial cell[J].Biochem J，2005，387(Pt3):609-616.

[6]Zhang JG，Krajden OB，Kainthan RK，et al.Conjugation to heperbranched polyglycerols improves RGD-mediated inhibition of platelet function in vitro.Bioconjug Chem，2008，19:1241-7.

[7]景丽丽，周建中，张良珂.RGD 靶向溶栓药物的研究进展[J].心血管病学进展.2010，31:209-212.

[8]杨可，杨震，王德强，周建中，等.重组葡激酶的表达纯化及纤溶活性鉴定[J].重庆医科大学学报，2012，37:232-235.

[9]陈检，杨可，王德强，周建中，等.重组葡激酶-人HC蛋白融合蛋白的原核表达、纯化及鉴定[J].细胞与分子免疫学杂志，2012，28:1208-1211.

[10]Zhang Y，Gao Z，Zhang Z，et al.Cloning，purification，crystallization and preliminary X-Ray sstudies of human α1-microglobulin[J].Acta Crystallogr Sect F Stryc Biol Cryst Commun，2012，68(pt 6):692-694.

[11]徐珍，张玉芹，聂永莉.不同酶切体系对胶回收纯化DNA浓度的影响[J].医学研究杂志，2010，39:54-57.

[12]Sugimoto K，Ohkawara H，Nakamura Y，et al.Receptor for advanced glycation end products-membrane type1 matrix metalloproteinase axis regulates tissue factor expression via RhoA and Rac1 activation in high-mobility group Box-1 stimulated endothelial cells[J].US National Library of Medicine National Institutes of Health，2014，9.

[13]Kowalski M，Brown G，Bieniasz M，et al.Cloning and expression of a new recombinant thrombolytic and anthithrombotic agent-a staphy-lokinase variant[J].Acta Biochimica Polonica，2009，56:41-53.