人参皂苷Rg3对人肝癌细胞增殖、迁移、黏附和凋亡的影响及其作用机制

尹天翔，王燕燕，2*

(1.三峡大学 第一临床医学院 宜昌市中心人民医院;2.国家中医药管理局 中药新制剂研究与开发实验室(二级)，湖北 宜昌443003)

肝癌严重危害着人类健康，大多数肝癌患者在被确诊时已是中晚期，且肿瘤细胞容易转移，目前尚无有效控制肿瘤转移的药物和方法[1]。研究发现人参皂苷Rg3(Ginsenoside，GS)能选择性地抑制肿瘤细胞侵袭和转移，并能使增殖的癌细胞逆转为正常细胞[2]。但是，有关人参皂苷在人肝癌细胞中的生物学功能的研究甚少，其能否发挥特异性作用抑制人肝癌细胞增殖、黏附、迁移，诱导细胞凋亡及其作用机制尚未知。因此，本实验以典型人肝癌细胞系HepG2，QGY和人成纤维细胞系HEL 为研究对象，观察人参皂苷Rg3对其细胞增殖、黏附能力、迁移及细胞凋亡的作用并检测Rg3对人肝癌细胞中血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和CD44 蛋白表达的影响以揭示其作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞系与试剂

人肝癌细胞系HepG2和QGY细胞(中国科学院上海细胞生物研究所);人成纤维细胞系HEL(本实验室保存);人参皂苷Rg3，纯度＞99.5%(Fluk公司);胰蛋白酶、胎牛血清(FBS)、RPMl-1640 培养基(Gibco 公司)、青霉素和链霉素(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司);MTT(Sigma 公司);兔抗人VEGF、CD44、抗肌动蛋白(β-actin)多克隆抗体(北京博奥森公司);辣根标记山羊抗兔IgG 二抗(中杉金桥公司);BCA蛋白浓度检测试剂盒(Thermo 公司);AnnexinV-FITC/PI 双染细胞凋亡检测试剂盒(南京博泰生物技术有限公司);Transwell 板(Corning 公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养:HepG2，QGY和HEL细胞培养于含10%胎牛血清、1%双抗的RPMl-1640 培养基中，置于37℃、5% CO2的培养箱内。待细胞贴壁达到80%～90%汇合时进行细胞传代，按细胞密度传到细胞培养瓶中正常培养。

1.2.2 MTT法检测Rg3对HepG2，QGY和HEL细胞增殖:将增殖期的HepG2，QGY和HEL细胞经0.25%胰蛋白酶消化，以2×104个/孔接种于96孔板中，设置6个复孔，培养24 h。后加入100 μL 不同终浓度Rg3(0.03，0.06，0.12，0.24 和0.48 mmol/L)的RPMl-1640完全培养基，同时设置对照组(含0.01% DSMO的RPMl-1640 完全培养基)，分别培养24 和48 h。每孔加入20 μL 5 g/L的MTT，继续培养4 h，弃上清每孔加入150 μL DMSO，酶标仪测定492 nm 处各孔吸光度值(A值)。计算细胞生长抑制率:

1.2.3 Anannexin V/PI 双染色流式细胞仪测定细胞凋亡:将增殖期的HepG2，QGY和HEL细胞经消化后接种到24孔板中，培养24 h后弃掉培养基，加入含终浓度为0.24 mmol/L Rg3的RPMI-1640 完全培养基作用48 h，同时设置对照组。然后用PBS 洗涤3次，用无EDTA的0.25%胰蛋白酶消化细胞，离心收集细胞，按照Annexin-V/PI 试剂盒说明书操作，运用流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.2.4 MTT法检测细胞黏附率:向96孔板中加入30 μL 100 mg/L 人纤维连接蛋白，置于37℃静置1 h，PBS 洗涤3次，室温下晾干备用。将增殖期的HepG2，QGY和HEL细胞以4.5×104个/孔接种培养6 h，各加入终浓度为0.24 mmol/L的Rg3 100 μL，培养箱内分别培养30 和60 min，吸出培养液，MTT法检测。计算细胞黏附率:

1.2.5 Transwell 法检测细胞迁移:将HepG2，QGY和HEL细胞消化重悬，后在Transwell 孔上室中加入4.5×104个细胞，下室中加入600 μL 含10%FBS的RPMl-1640 完全培养基，37℃继续培养6 h后，4%多聚甲醛固定，乙醇脱水，结晶紫染色，洗涤。用棉签轻轻擦去上室的贴壁细胞，在显微镜下拍照并计数从Transwell 上室迁移至微孔膜下层的细胞，以比较细胞的纵向趋化迁移能力。

1.2.6 Western blot检测细胞VEGF 和CD44 蛋白表达:将HepG2和QGY细胞培养在6孔板上，24 h加入终浓度为0.24 mmol/L Rg3的RPMl-1640 完全培养基2 mL，继续培养48 h后收集细胞。用RIPA细胞裂解液提取细胞中蛋白，按照BCA 试剂盒测定蛋白浓度。将总蛋白50 μg 进行SDS-PAGE 凝胶电泳，转膜，封闭，洗涤，孵育一抗(VEGF 抗体，CD44抗体，β-actin 抗体均为1∶1 000)，4℃过夜。然后膜经洗涤，孵育二抗(1∶5 000)，洗涤。ECL 化学发光后扫描，VEGF 和CD44 蛋白表达灰度值经Quanity-One 软件分析。

1.3 统计学分析

应用SPSS17.0 统计软件进行相关数据分析，结果用平均值±标准差(±s)表示，统计学分析采用t检验。

2 结果

2.1 Rg3 能够抑制肝癌细胞的增殖

当Rg3浓度为0.06 mmol/L时即可抑制HepG2，QGY细胞的增殖(P＜0.05)，Rg3浓度在0.24～0.48 mmol/L时，抑制作用与对照组比较差异极显著(P＜0.01)。Rg3对肝癌细胞的抑制率与浓度呈时间-剂量依赖关系(图1，图2)。

图1 MTT法测定Rg3 作用24 h 对HepG2，QGY和HEL细胞的增殖抑制Fig1 The 24 hours cell proliferation inhibition rate of Rg3 on HepG2，QGY，HEL cell were detected by MTT assay (±s，n=10)

图2 MTT法测定Rg3 作用48 h 对HepG2，QGY和HEL细胞的增殖抑制情况Fig2 The 48 hours cell proliferation inhibition rate of Rg3 on HepG2，QGY，HEL cell were detected by MTT assay (±s，n=10)

2.2 Rg3 能诱导肝癌细胞凋亡率

Rg3浓度在0.24 mmol/L时，HepG2和QGY细胞的凋亡率分别为34.3%和36.2%，同等条件下，PBS 处理组肝癌细胞凋亡率明显低于实验组(P＜0.05)(图3)。

图3 流式细胞仪检测Rg3对HepG2和QGY细胞的凋亡Fig3 The apoptosis rates of HepG2 and QGY cells treated with Rg3 were detected by flow cytometry

2.3 Rg3 特异性抑制肝癌细胞的黏附力

HepG2和QGY细胞的黏附抑制率显著增强，而非癌细胞HEL的黏附抑制率无变化。与PBS组处理的细胞比较HepG2和QGY细胞分别培养30 和60 min时的细胞黏附抑制率显著升高(P＜0.01)(图4)。

2.4 Rg3 阻滞肝癌细胞的迁移

Rg3 能阻滞肝癌细胞的迁移，实验组HepG2和QGY细胞的迁移数量比PBS组细胞的迁移数量减少1.50倍和1.63倍(P＜0.05)(图5)。

图4 Rg3对HepG2，QGY和HEL细胞黏附力的影响Fig4 The effect of Rg3 on the cell adhesion inhibition rate of HepG2，QGY，HEL cells (±s，n=10)

图5 Rg3对HepG2、QGY和HEL细胞迁移的影响Fig5 The effect of Rg3 on the cell migration of HepG2，QGY and HEL cells(±s，n=10)

2.5 Rg3对肝癌细胞CD44和VEGF蛋白表达的影响

与PBS 处理组比较，Rg3 处理组HepG2和QGY细胞中CD44和VEGF蛋白表达均显著下调(P＜0.01)(图6，7)。

图6 Western blot检测Rg3对肝癌细胞中CD44和VEGF蛋白表达影响Fig6 The effect of CD44 and VEGF protein expression of Rg3 on liver cancer cells by Western blot

图7 Rg3对肝癌细胞中CD44和VEGF蛋白相对表达量Fig7 The relative expression of CD44 and VEGF protein(±s，n=10)

3 讨论

人参皂苷Rg3是存在于中药人参中的四环三萜皂苷，Rg3 具有提高机体免疫力、抑制血小板聚集、扩张血管等作用[3]。Rg3 可能与抑制癌细胞对血管壁基底膜及周围组织的侵袭和转移活性有关[4]。本实验结果也显示，Rg3 能特异性抑制肝癌细胞HepG2和QGY的增殖，与报道的结果[4]具有一致性。同时本研究发现Rg3 能显著诱导肝癌细胞HepG2和QGY的细胞凋亡及抑制细胞黏附和转移。而Rg3 在体外对小鼠腹水肝癌细胞(MM1)、黑色素瘤细胞(B16FE7)、人小细胞肺癌细胞(OC-10)和人胰腺癌细胞(PSN-1)的侵袭都具有较强的抑制作用[5]。本研究证实Rg3对人HepG2和QGY 肝癌细胞的细胞功能具有抑制作用。

CD44是与肿瘤侵袭与转移密切相关的蛋白，其表达可能与肝癌细胞的血管侵袭潜能密切相关[6]。而VEGF 作为血管内皮生长因子能促进肿瘤血管形成，因而与肿瘤的生长、侵袭及转移关系密切。肝癌组织中癌栓组VEGF mRNA表达水平显著高于癌旁组织，提示VEGF的高表达与肝癌细胞的侵袭与转移有关[7]。本研究发现，Rg3 能抑制肝癌细胞HepG 和QGY 中CD44和VEGF的表达，提示Rg3 可能通过调节肿瘤组织某些与侵袭与转移相关蛋白的表达而发挥抑制细胞肿瘤细胞增殖，抗黏附、侵袭和转移作用。同时报道表明[8]，Rg3对肺癌细胞、胃癌细胞条件培养液诱导的内皮细胞增殖具有抑制作用，Rg3 能抑制卵巢癌SCID 鼠腹腔移植瘤VEGF的表达。因此，本研究提示，CD44和VEGF蛋白表达在Rg3 抑制肝癌细胞HepG2和QGY 增殖、黏附、迁移，诱导细胞凋亡中发挥着重要作用。

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