RNA干扰Tb人舌癌细胞整合素连接激酶基因表达可抑制移植瘤生长

幸 宇，邓世雄，齐 进，姜 容，陈俊霞

(重庆医科大学1.基础医学院 法医学与生物信息学研究室;2.附属口腔医院;3.基础医学院 干细胞与组织工程研究室;4.基础医学院 分子医学与肿瘤研究中心，重庆400016)

舌癌是最为常见的口腔恶性肿瘤，男性多于女性，多数为鳞状细胞癌。近年来舌癌的发病率不断增长，并呈现年青化趋势，且预防效果及早期确诊差，愈后差，易转移，5年生存率仅50%左右[1-2]。

在由整合素与细胞外基质(extracellular matrix，ECM)相互作用而引发细胞应答反应中，整合素连接激酶(integrin-linked kinase，ILK)通过其丝氨酸/苏氨酸激酶活性介导细胞内外的信号传导而起着重要作用[3]。除了参与某些基本的细胞生理过程外，ILK 还与多种肿瘤的发生和转移相关。前期作者报道了抑制ILK表达对舌癌Tb 细胞在体外的增殖、转移和侵袭等方面可以产生抑制作用[4]。在此基础上，作者建立裸鼠Tb 细胞移植瘤模型，进一步观察ILK 沉默后对信号传导分子Akt、GSK3β 及其磷酸化状态，以及对移植瘤生长、病理形态、微血管形成情况等方面的影响，并探讨其可能参与肿瘤细胞生长的机制，以期为舌癌的治疗寻找新思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞、质粒及实验动物:Tb人舌鳞癌细胞(湖南湘雅医学院)、ILK siRNA表达质粒(重庆医科大学细胞生物学及遗传学教研室构建及保存[4-5])。SPF级BALB/c 裸鼠(雌雄不限)24只，4～6周龄，体质量(20±3)g[北京华阜康生物科技股份有限公司，合格证号SCXK(京)2009-004]。

1.1.2 试剂:胎牛血清(Hyclone 公司)，DMEM 培养基及G418 (Gibco-BRL 公司)，脂质体Lipofectamine 2000 试剂(Invitrogen 公司)，鼠抗人ILK单克隆抗体(Santa Cruz 公司)，兔抗人CD31、p-Akt、Akt、p-GSK3β、GSK3β 抗体(Bioworld 公司)，FITC包被的羊抗兔二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司)，其他试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养、转染和筛选:Tb 细胞在37℃，5% CO2饱和湿度孵育箱中，用含5%胎牛血清的DMEM 培养基进行常规培养。将对数增殖期细胞按2×105个/孔接种至6孔板，当细胞达70%左右汇合度时，以未转染细胞为正常组，用脂质体Lipofectamine 2000 将ILK siRNA表达质粒及阴性对照质粒分别转染细胞。48 h后以G418 进行筛选，前2周G418 为0.3 mg/mL，后6 周减半培养，获得稳定表达质粒的系，分别命名为Tb 细胞组(未转染质粒的正常Tb 细胞)，Tb vector 细胞组(转染阴性对照质粒的Tb 细胞)，Tb siILK 细胞组(转染ILK siRNA质粒的Tb 细胞)。

1.2.2 Western blot检测ILK表达:常规提取细胞总蛋白，5%浓缩胶上样40 μg/孔，60 V 电泳，当蛋白质进入10% SDS-PAGE 凝胶时改为100 V 电泳1 h，常规湿法转膜，5%脱脂奶粉封闭1.5～2 h，ILK鼠单抗(1∶300 稀释)4℃孵育12 h，HRP 标记的羊抗鼠IgG(1∶1 000 稀释)37℃孵育2 h，ECL 化学发光显色，Bio-Rad 凝胶成像仪观察照相，Quantity One图像分析。

1.2.3 免疫荧光法检查瘤细胞中Akt、p-Akt、GSK3β和p-GSK3β表达:6孔板内放置盖玻片，接种各组细胞制作细胞爬片。待细胞增殖为单层时(达80%以上汇合度)，用80%冰丙酮固定10 min，PBS(含3%BSA)37℃封闭30 min，分别以Akt、p-Akt(S473)、GSK3β 和p-GSK3β(S9)抗体(均按1∶300 稀释)4℃孵育过夜，PBS 清洗5 min×3次，FITC 包被的羊抗兔二抗(1∶100 稀释)于37℃避光孵育1 h，PBS 清洗5 min×3次，50%甘油封片。使用激光共聚集显微镜(Leica TCS-SP2)观察并拍照，SPOT 3.5 软件分析结果。

1.2.4 裸鼠移植瘤模型:胰蛋白酶消化细胞，PBS洗涤，制备成0.1 mL 含有2×106细胞的悬液。将裸鼠以随机数字表法分成3 组，每组8只，分别将前述3 组细胞悬液接种至裸鼠背部皮下，观察各组细胞在裸鼠体内的成瘤率、肿瘤大小及生长速度，5周后处死裸鼠，称取肿瘤质量，对裸鼠内脏器官进行常规病理学检查，并由2名工作8年以上的病理科医生分别复核认定。抑瘤率=[1 － 平均瘤质量(Tb siILK 组)/平均瘤质量(Tb组或Tb vector 组)]×100%。

1.2.5 HE染色及免疫荧光检查移植瘤CD31、p-Akt和p-GSK3β表达:10%多聚甲醛溶液固定肿瘤组织及肺组织。常规脱水、石蜡包埋，制成5 μm 厚组织切片，二甲苯和梯度乙醇常规脱蜡至水，苏木精染色4 min，1%盐酸乙醇分色15 s，流水冲洗，蒸馏水清洗3次，伊红染色5 min，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下观察并拍照。瘤组织于高倍镜下随机选取10个视野对微血管数目进行计数并取平均值。瘤组织的CD31、p-Akt 和p-GSK3β的免疫荧光检查步骤同1.2.2 所述。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 ILK蛋白表达检测

ILK蛋白的表达水平Tb siILK 组分别为Tb组和Tb vector 组的66%和67%，表达明显下降(P＜0.01)(图1)。

图1 Western blot检测细胞ILK蛋白的表达Fig1 Western blot of ILK protein in Tb cells of each group

2.2 ILK siRNA对Tb 细胞及移植瘤Akt 和GSK3β表达的影响

Tb siILK 组与Tb组和Tb vector 组的细胞相比，Akt 和GSK3β 在细胞质中的平均荧光强度(mean fluorescence intensity)无明显改变，而 p-Akt 和p-GSK3β的平均荧光强度则明显减弱(图2);与体外实验相似，在移植瘤组织切片中，Tb siILK 组的p-Akt和p-GSK3β的平均荧光强度也明显减弱(图3);在体外和体内实验中，前述各指标在Tb组和Tb vector 组之间表达情况相似。

2.3 ILK siRNA对裸鼠移植瘤生长的影响

Tb组和Tb vector 组裸鼠于接种后3 d 开始成瘤;Tb siILK 组于接种后5 天开始成瘤。5周后处死裸鼠，取出瘤体并称其质量。Tb siILK组(1.68±1.35)g 较Tb组(3.58±1.04)g 与Tb vector组(3.64±0.65)g，瘤体质量显著降低(P＜0.05)，抑瘤率分别为53.0%和53.8%(图4)。

2.4 移植瘤组织学观察

Tb组和Tb vector 组移植瘤组织内可见坏死及出血灶，癌细胞体积大而不均匀，核分裂相较多，核质比增大，而Tb siILK 组癌细胞较前2 组体积减小，核分裂相较少，核质比例缩小(图5)。

2.5 ILK siRNA对裸鼠移植瘤自发性转移的影响

Tb组和Tb vector 组裸鼠肺组织内均发现自发性转移瘤细胞巢生成，而Tb siILK 组裸鼠肺组织内未发现自发性转移瘤细胞巢，各组裸鼠的肺以外器官未发现自发性转移瘤(图6)。

2.6 ILK siRNA对裸鼠移植瘤瘤体微血管的影响

HE 检查显示Tb siILK 组瘤组织内微血管计数(5.6±2.2)/视野较Tb组(15.3±2.3)/视野和Tb vector组(14.6±1.4)/视野组明显减少(图5)，免疫荧光检查显示Tb siILK 组瘤组织内CD31 阳性细胞明显较Tb组和Tb vector 组减少(P＜0.05)，与HE 检查结果一致(图7)。

图2 各组细胞中Akt，GSK3β，p-Akt 和p-GSK3β的免疫荧光检查Fig2 In vitro immunofluorescence of Akt，GSK3β，p-Akt and p-GSK3β(×400)

图3 各组移植瘤中p-Akt 和p-GSK3β的免疫荧光检查Fig3 In vivo immunofluorescence of p-Akt and p-GSK3β(×200)

图4 各组移植瘤肉眼检查Fig4 Morphology of xenograft tumor in each group

图5 各组移植瘤HE染色Fig5 HE examination for xenograft tumor(×400)

图6 肺内自发性转移瘤检查Fig6 Spontaneous metastasis tumor in lung(×100)

图7 瘤组织微血管免疫荧光检查Fig7 Immunofluorescence examine of micro blood vessel in xenograft tumor(×200)

3 讨论

ILK[3，6]介导由整合素与细胞外基质[7]作用引发的细胞应答反应，除参与如细胞生长、分化等基本生理过程，还与肿瘤的血管生成、瘤细胞黏着、侵袭和迁移等过程密切相关[8]。研究表明，ILK的表达和活性在人类多种恶性肿瘤中均明显升高[9]。抑制ILK 活性，对消化道、乳腺和膀胱等的肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭和血管生成可产生抑制作用。有报道[10]认为ILK 对肿瘤细胞的调控机制存在细胞特异性，而抑制ILK 对口腔肿瘤的影响目前罕有报道。在前期研究中作者发现，抑制ILK表达对体外培养的Tb 舌癌细胞增殖、细胞周期、迁移和侵袭能力产生抑制作用。肿瘤的生长和转移须依赖血管生成提供充足养分和氧气，本研究证实在体内实验中，抑制ILK表达，肿瘤血管生成也明显减少，且Tb siILK 组肿瘤自发性转移受到明显抑制;Tb siILK 组移植瘤成瘤时间较Tb组和Tb vector 组延长，成瘤率及瘤体质量也较之明显下降，病理学检查发现Tb siILK组移植瘤细胞体积减小，核分裂相较少，核质比例缩小;本实验证实对ILK表达抑制可对肿瘤细胞增殖及血管生成产生抑制作用。

GSK3β 对维持细胞的“上皮化状态”有重要作用。ILK 通过其磷酸化酶活性对其下游底物Akt 和GSK3β 进行磷酸化。另外ILK 和Akt 均可磷酸化GSK3β 而使之失活，激活Akt/GSK3β/Snail 通路进而介导上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)。抑制ILK 可抑制Akt 和GSK3β的磷酸化，即Akt的活性被抑制而GSK3β的失活被阻止，故抑制ILK 可抑制Akt/GSK3β/Snail 通路。研究证实抑制ILK 和Akt 活性对乳腺癌细胞EMT 现象及肺癌细胞增殖起到抑制[11-12]。本实验发现抑制ILK表达抑制了Tb 舌癌细胞的Akt 和GSK3β 磷酸化，而对非磷酸化Akt 和GSK3β的水平无明显影响，进一步证实了前述发现，提示ILK 可能通过Akt/GSK3β/Snail 在EMT 现象中起到重要作用。由于ILK信号通路十分复杂，本研究将进一步检验抑制ILK 对其他信号传导通路影响，以期深入地阐明抑制ILK 对舌癌细胞增殖、侵袭、转移等方面的调控机制。

综上所述，本研究发现抑制ILK表达，体内外培养的Tb 细胞中Akt 和GSK3β的磷酸化受到抑制，移植瘤增殖、血管生成和自发性转移均受到明显抑制，提示ILK 有望成为抗肿瘤治疗的靶基因。

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