IL-31对人支气管上皮16HBE细胞VEGF、EGF及EGFR表达的影响及作用机制

黄海良，丁伟伟，张胜权，罗 欣

(1.安徽医科大学 生物化学与分子生物学教研室，安徽 合肥230032;2.安徽中医药大学研究生院，安徽 合肥230031)

白细胞介素-31(interleukin-31，IL-31)属于IL-6家族成员，主要由激活的CD4+Th2细胞所产生，主要生物学功能包括调控炎症及免疫反应、诱导细胞因子和趋化因子分泌及调节细胞增殖与分化。最近的研究表明，IL-31 与呼吸系统疾病，例如支气管哮喘及慢性阻塞性肺疾病(COPD)等的气道炎性反应和气道重塑密切相关[1-3]。本实验拟通过研究IL-31对人支气管上皮细胞(16HBE)血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、细胞表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)和表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)的影响及作用机制，为进一步研究其参与气道重塑的发病机制奠定基础，为气道重塑的临床治疗提供帮助。

1 材料与方法

1.1 细胞及试剂

16HBE细胞(上海博谷生物科技有限公司);IL-31(北京义翘神州生物技术有限公司);RNA 提取试剂盒和real-time PCR 试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司);反转录试剂盒(Thermo Fish 公司);RPMI1640 细胞培养基和胎牛血清(Gibco 公司);β-actin、P38 MAPK、p-P38 MAPK、JNK 和p-JNK抗体(Santa Cruz 公司)。

1.2 PCR引物设计

荧光定量PCR引物由上海生工生物科技有限公司设计、合成(表1)。

1.3 细胞培养及处理

使用RPMI1640 培养基培养16HBE细胞，待细胞增殖至汇合度为80%～90%时，弃培养液并用无菌PBS 清洗2次，然后用0.25%胰蛋白酶消化细胞3 min，细胞计数后按1×105个细胞/孔接种于6 孔培养板，37℃，5% CO2培养箱中继续培养至细胞汇合度为80%时，更换为无血清培养基。

表1 Real-time PCR引物Table1 Primer sequences of real-time PCR

用0、1、10、100 和500 ng/mL的IL-31 处理16HBE细胞24 h，real-time PCR检测VEGF、EGF 和EGFR mRNA的表达。选取100 μg/L的IL-31 分别处理16HBE细胞0、3、6、12、24 和48 h 以及0、5、15、30 和60 min，用real-time PCR检测VEGF、EGF和EGFR mRNA的表达及Western blot检测P38 MAPK 和JNK磷酸化水平。用100 μg/L的IL-31单独及分别联合 SB203580 (10 μmol/L)或SP600125(2 μmol/L)处理16HBE细胞24 h，应用real-time PCR 和Western blot 分别检测VEGF、EGF和EGFR mRNA 和蛋白水平的变化。IL-31 与抑制剂联合应用时，抑制剂先于IL-31 1 h 加入。

1.4 Real-time PCR检测VEGF、EGF 和EGFR mRNA的表达

无菌PBS 洗涤16HBE细胞3次，按RNA 提取试剂盒操作说明书提取细胞总RNA。以RNA 为模板，参照反转录试剂盒说明书进行cDNA 第一链的合成。以cDNA 为模板ABI7500 real-time PCR 仪上检测VEGF、EGF 和EGFR mRNA表达，同时以GAPDH 作为内参，采用2－△△Ct法进行比较分析。realtime PCR 反应程序如下:95℃15 s，60℃1 min，共计40个循环。

1.5 Western blot检测VEGF、EGF、EGFR 及P38 MAPK、JNK信号通路的变化

用RIPA细胞裂解液提取细胞总蛋白，BCA法定量后，按50 μg /孔的量加样、电泳。150 mA、2 h分别将目的蛋白转移至PVDF膜上，50 g/L 脱脂奶粉室温封闭2 h。抗VEGF、EGF、EGFR、P38 MAPK、p-P38 MAPK、JNK 和p-JNK 抗体分别按1 ∶500 稀释，抗β-actin 抗体按1∶1 000 稀释，4℃孵育过夜。TBST 洗膜3次，每次5 min，相应二抗按1∶10 000 进行稀释，室温孵育2 h。TBST 洗膜3次，每次10 min，ECL 发光、显影、定影。以β-actin 作为内参，分析各目的蛋白/β-actin的吸光度比值，并进行统计学分析。

1.6 统计学分析

每组实验均重复3次，采用SPSS11.0 统计软件进行统计分析，结果以均数±标准差(±s)表示。组间比较使用One-way ANOVA 和t 检验进行统计分析。

2 结果

2.1 IL-31对VEGF、EGF 和EGFR mRNA表达的影响

与对照组相比，浓度为10、100 和500 μg/L的IL-31 均显著上调VEGF、EGF 和EGFR mRNA的表达(P＜0.01)(图1A)，而100 μg/L的IL-31 干预3、6、12、24 和48 h 均显著促进VEGF、EGF 和EGFR mRNA的表达(P＜0.01)(图1B)。

图1 IL-31对16HBE细胞VEGF、EGF 和EGFR mRNA表达的影响Fig1 Effects of IL-31 on the mRNA expression of VEGF，EGF and EGFR in 16HBE cells(±s，n=6)

2.2 IL-31对16HBE细胞P38 MAPK 和JNK磷酸化水平的影响

与对照组相比，100 μg/L的IL-31 干预16HBE细胞5 min后即可明显促进P38 MAPK 和JNK磷酸化的表达水平，其中IL-31 干预5、15 和30 min(P＜0.01)，IL-31 干预60 min(P＜0.05)(图2)。

图2 IL-31对16HBE细胞P38 MAPK 和JNK磷酸化表达的影响Fig2 Effects of IL-31 on the phosphorylation expression of P38 MAPK and JNK

2.3 特异性信号通路阻断剂对IL-31激活的信号通路的影响

与对照组相比，IL-31 可显著促进P38 MAPK 和JNK磷酸化的表达水平(P＜0.01);与IL-31 组相比，IL-31+SB203580 或SB203580 组p-P38 MAPK的表达水平均明显下降(P＜0.01)，而IL-31+SP600125 或SP600125 组p-JNK的表达水平均明显下降(P＜0.01)(图3)。

图3 特异性信号通路阻断剂对IL-31激活的信号通路的影响Fig3 Effects of Specific inhibitors on IL-31-induced signal pathways

2.4 IL-31 分别联合SB203580 或SP600125 对VEGF、EGF 和EGFR表达的影响

与对照组相比，IL-31 组VEGF、EGF 和EGFR 在mRNA 和蛋白水平均显著升高(P＜0.01);与IL-31组相比，IL-31 分别联合SB203580 或SP600125，VEGF mRNA 和蛋白表达水平发生显著下降(P＜0.01)，而EGF 和EGFR的表达水平在IL-31 联合SB203580时显著下降(P＜0.01)(图4)。

图4 IL-31 单独及分别联合SB203580 或SP600125 对VEGF、EGF 和EGFR 蛋白表达的影响Fig4 Effects of IL-31 on the protein expression of VEGF，EGF and EGFR with or without SB203580 or SP600125

3 讨论

气道重塑与气道慢性炎性反应、气道上皮细胞增生、迁移以及气道平滑肌细胞增生等密切相关。IL-31是机体重要的促炎症性细胞因子，最近的研究表明IL-31 参与了哮喘气道炎性反应、气道重塑，其作为炎性介质介导了支气管哮喘、COPD 等慢性呼吸系统疾病的发生发展。

VEGF是内皮细胞的强效诱导剂，可促进内皮细胞的迁移、增殖以及新生血管的生成等[4-6]。研究发现，哮喘患者气道黏膜组织VEGF、Flt-1 和Flk-1 mRNA的表达量显著高于正常组，并且与气道密度呈正相关[7]。EGF、EGFR是调节细胞分裂的重要因子，对细胞增殖与分化起着重要作用[8-9]。研究表明，组胺在支气管上皮细胞当中能够通过诱导EGFR 配体的表达进而活化EGFR，参与气道重塑[10]。同样，有研究表明与正常小鼠相比，慢性哮喘小鼠肺组织中EGF 和EGFR的表达显著增强，进一步证实了EGF 和EGFR 在气道损伤修复及气道重塑中起着重要作用。此外，使用EGFR的阻滞剂吉非替尼可以抑制哮喘小鼠气道黏液的分泌，提示EGFR 参与了哮喘杯状细胞黏液的分泌、化生、抗凋亡的发病机制，进而导致气道上皮的异常增殖、气道壁增厚及气道重塑[11-12]。

P38 丝裂原活化蛋白激酶(P38 MAPK)和c-JUN氨基末端激酶(JNK)信号通路是机体内重要的信号传导通路，主要参与调控机体炎性反应、细胞周期，细胞发育、分裂和分化等[13-14]。研究表明，P38 MAPK信号通路参与了低氧预适应小鼠的抗凋亡过程，对缺血脑组织损伤起到了保护作用[15]。

本研究发现，IL-31 能够上调16HBE细胞VEGF、EGF 和EGFR的表达，并具有剂量效应，提示IL-31 可能参与了上皮细胞的炎性损伤-修复机制、介导了上皮细胞的增生，进而介导了气道重塑的发生。进一步的机制研究表明，IL-31 可通过激活P38 MAPK 和JNK信号通路而诱导的VEGF 以及通过激活P38 MAPK信号通路而诱导EGF 和EGFR的表达。因此，推测IL-31 可通过激活P38 MAPK 和JNK信号通路进而介导了气道重塑的发生，为进一步深入研究IL-31 在气道重塑中分子生物学作用机制奠定了基础。

[1]Zhang Q，Prabhakar P，Zhou Q，et al.Structures and biological functions of IL-31 and IL-31 receptors[J].Cytokine Growth Factor Rev，2008，19:347-356.

[2]Stott B，Lavender P，Lehmann S，et al.Human IL-31 is induced by IL-4 and promotes TH2-driven inflammation[J].J Allergy Clin Immunol，2013，132:446-454.

[3]Yu JI，Han WC，Yun KJ，et al.Identifying Polymorphisms in IL-31 and their association with susceptibility to asthma[J].Korean J pathol，2012，46:162-168.

[4]Papadaki G，Bakakos P，Kostikas K，et al.Vascular endothelial growth factor and cysteinyl leukotrienes in sputum supernatant of patients with asthma[J].Respir Med，2013，107:1339-1345.

[5]Takyar S，Vasavada H，Zhang JG，et al.VEGF controls lung Th2 inflammation via miR-1-Mpl(myeloproliferative leukemia virus oncogene)-P-selectin axis[J].J Exp Med，2013，210:1993-2010.

[6]杨炼，王娅兰，盛永涛，等.大肠癌ART1的表达与VEGF、整合素Vβ3表达及微血管形成的相关性[J].基础医学与临床，2012，32:1064-1069.

[7]Hoshino M，Fujita Y，Saji J，et al.Effect of suplatast tosilate on goblet cell metaplasia in patients with asthma[J].Allergy，2005，60:1394-1400.

[8]Sako Y，Minoghchi S，Yanagida T.Single-molecule imaging of EGFR signaling on the surface of living cells[J].Nat Cell Bil，2000，2:168-172.

[9]Uddin M，Lau LC，Seumois G，et al.EGF-induced bronchial epithelial cells drive neutrophil chemotactic and antiapoptotic activity in asthma[J].PLoS One，2013，8:e72502.doi:10.1371/journal.pone.0072502.

[10]Nobuaki H，Paul-Andre R，Mauro N，et al.Histamine may induce airway remodeling through release of epidermal growth factor receptor ligands from bronchial epithelial cells[J].FASEB，2012，26:1704-1716.

[11]曹卫军，李强，刘忠令.慢性哮喘小鼠EGFR的表达及地塞米松对其的影响[J].第四军医大学学报，2006，27:125-128.

[12]刘大鹏，宋立强.干预支气管哮喘小鼠气道黏液高分泌的研究[J].中华肺部疾病杂志:电子版，2013，6:23-26.

[13]Kumasawa F，Hashimoto S，Mizumura K，et al.Mitogen-activated protein kinase(MAPK)regulates D4-induced HBEGF and ADAM12 expression in human airway smooth muscle cells[J].Asian Pac J Allergy Immunol，2013，31:58-66.

[14]Johnson GL，Lapadat R.Mitogen-activated protein kinase pathways mediated by ERK，JNK and P38 protein kinases[J].Scince，2002，298:1911-1912.

[15]梁婧，杜建丽，朱熠婧，等.P38 MAPK-BCL-xL 途径参与低氧预适应减轻小鼠脑缺血性损伤[J].基础医学与临床，2010，30:1127-1131.