重组腺相关病毒表达干扰素α体外抑制乙肝病毒的复制

朱 江，高 蕾

(1.成都学院 医护学院 病原免疫教研室，四川 成都610106;2.中国医学科学院 输血研究所，四川 成都610052)

中国是乙型肝炎的高流行区，一般人群乙肝表面抗原(hepatitis B surface antigen，HBsAg)阳性率为7.18%[1]。目前，治疗乙型肝炎的主要方法是干扰素和核苷类似物。使用的干扰素均是外源性干扰素，有很多乙肝患者对于干扰素不敏感，导致治疗无效，且干扰素需要长期使用，增加了患者的负担[2]。重组腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)载体被广泛应用到基因治疗和临床前或临床实验中，尝试着进行多种疾病的治疗[3-4]。HepG2.2.15细胞能产生完整的HBV，稳定分泌HBsAg 和HBeAg，常被作为体外评估抗HBV 药物效果的细胞模型[5]。本实验利用重组病毒AAV-IFN 感染HepG2.2.15细胞的方法，介导干扰素在体内表达，产生内源性干扰素并对其抗病毒效果进行评估。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料:细胞及质粒:293T细胞、HepG2.2.15细胞、pAAV-IFN(将IFN 基因克隆于去除Rep 和Cap 基因的含有腺相关病毒6型TR 结构的pAAV骨架质粒中获得)、Pxx680(辅助质粒)、Pxr2、Pxr6、Pxr7、pXR8(包装质粒)、pSC-gfp (含有绿色荧光蛋白基因的质粒)和PCP10(含有2个拷贝HBV 基因组的质粒作为Q-PCR 进行HBV 定量的标准品)(中国医学科学院输血研究所输血传播疾病研究实验室冻存)。

试剂:DMEM 高糖培养基和青霉素-链霉素(Hyclone 公司);血清(Gbico 公司);G418 和MTT 试剂盒(Sigma 公司);DNeasy blood＆ tissue kits(Qiagen 公司);人HBsAg ELISA 检测试剂盒和人HBeAg ELISA检测试剂盒(泉州市蓝图生物技术有限公司);小鼠ALT ELISA 检测试剂盒和小鼠AST ELISA 检测试剂盒(Quantikine® ELISA 公司);Fast Start Universal SYBR Green Master[Rox](Roche 公司);小鼠α 干扰素(IFNα)定量检测试剂盒(R＆D 公司)。

1.1.2 小鼠:SPF级BABL/c 小鼠，雄性，8～10周龄，体质量(18±2)g[成都达硕实验动物公司，合格证号:scxk(川)2013-24]。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养:293T细胞培养于完全培养基(DMEM 加入10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素);HepG2.2.15细胞培养于完全培养基并加入终浓度为400 mg/L的G418;培养条件均为37℃、5% CO2培养箱中培养。

1.2.2 重组病毒的制备与纯化:转染的前1 d，将汇合度达到90%以上的293T细胞，5% CO2、37℃培养。当293T细胞汇合度达到80%～90%时按1∶3的比例分成3盘，接种于新的培养皿内，利用3 质粒共转染技术进行转染，培养72 h 以后，收获病毒。收获的病毒利用氯化铯超速离心法进行纯化。

1.2.3 重组病毒AAV-GFP 感染HepG2.2.15细胞:感染的前1 d，将HepG2.2.15细胞以4×104个/孔接种于6孔板。次日，吸取6孔板内培养基，将2、6、7 和8 血清型的AAV-GFP 以MOI =103的感染剂量，分别接种于HepG2.2.15细胞，孵育1 h，倾倒出感染液，加入新鲜的培养基继续培养。感染72 h后，在荧光显微镜下观察GFP 在细胞内表达情况。

同时以质粒pSC-GFP 转染HepG2.2.15细胞作为阳性对照，HepG2.2.15细胞接种初始4×104个/孔，质粒pSC-GFP 用量3μg，转染试剂PEI 用量9 μg，转染72 h，荧光显微镜下观察GFP表达情况。

1.2.4 IFN 体内和体外稳定表达验证:设置PBS 空白对照组、AAV-GFP 阴性对照组、pAAV-IFN 转染阳性对照组和AAV6-IFN 实验组。

AAV6-IFN 感染HepG2.2.15细胞，感染方法同上，感染剂量为MOI =104，分别于1，3，6和9 d 收获培养上清，并利用ELISA 试剂盒测量上清中IFNα的表达量。

同时将AAV6-IFN 以5×1010μg/只的剂量，经尾静脉注射，在1、2、3 及6月取小鼠血液，将小鼠血液冰上放置30 min后，3 000 r/min 离心，收获血清－20℃冻存备用。全部样本用ELISA 试剂盒检测小鼠血清中IFN表达情况、ALT(丙氨酸转氨酶)和AST(天门冬氨酸转氨酶)含量变化。

1.2.5 重组AAV6-IFN 病毒感染HepG2.2.15细胞:AAV6-IFN 感染HepG2.2.15细胞，感染剂量为MOI=104，于1，3，6和9 d 收获各组培养上清及细胞。ELISA 试剂盒测量上清中HBsAg 和HBeAg的变化，并利用DNeasy blood ＆ tissue kits 提取培养上清和细胞中总DNA，qPCR 方法定量培养上清和细胞中HBV DNA 含量的变化。对HBV DNA 定量的qPCR 反应上游引物为5'-CGTTTTTGCCTTCTGACTT CTTTC-3'，下游引物为5'-ATAGGATAGGGGCATTTG GTGGTC-3'，扩增片段长度为372 bp;同时以质粒PCP10(包含2个拷贝的HBV 基因组的质粒)为标准品，进行10倍梯度稀释，以1.0×103～1.0×109copy/mL绘制标准曲线。

1.2.6 MTT法检测HepG2.2.15细胞增殖:取对数生长期细胞接种于96孔板中，每孔接种4×104个。培养12 h后，洗掉培养液，换1% 胎牛血清的培养基同步化12 h。设置PBS 为空白对照组;AAV-GFP 为阴性对照组;pAAV-IFN 为转染阳性对照组;AAV6-IFN 为实验组。剂量同上，每组样本设3个复孔，37℃、5% CO2孵箱分别培养24、48和72 h，每孔加入20 μL MTT 溶液(5 g/L)，继续培养4 h。弃上清液，每孔加入150 μL 二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。用酶标仪在波长570 nm 处测定A值，按以下公式计算抑制率:

抑制率=(空白对照组A值－实验组A值)/空白对照组A值×100%。

1.3 统计学分析

实验动物采用SPSS 17.0 软件，随机分组进行体内实验，结果以小鼠测量值的平均值±标准差(±s)表示，组间比较使用方差分析。

2 结果

2.1 AAV6 可有效介导GFP 在HepG2.2.15细胞内表达

在感染72 h后，AAV6-GFP(图1B)较其他血清型AAV2-GFP(图1A)，AAV7-GFP(图1C)，AAV8-GFP(图1D)，对于HepG2.2.15细胞有更强的感染效率。同时以PBS代替AAV-GFP 作为阴性对照(图1F)，72 h后未见GFP表达;以质粒pSC-GFP 转染HepG2.2.15细胞的阳性对照可明显观察到GFP表达(图1E)。

图1 不同血清型AAV-GFP 感染HepG2.2.15细胞后GFP的表达Fig1 Expression of GFP in HepG2.2.15 cells infected with different serotype AAV(×400)

2.2 重组AAV6-IFNα 介导IFN 在体内外有效表达

AAV6-IFNα 感染HepG2.2.15细胞3 d后，培养上清液中能检测出IFNα的表达;持续感染9 d后，表达量可达(36.63±3.27)ng/mL;同时质粒pAAV-IFNα 转染组培养上清中也检测到IFN表达，但是IFNα表达量没有AAV6-IFNα 感染组多(P＜0.01)(图2A)。

将AAV6-IFNα 尾静脉注射小鼠1个月后即可检测出血清中IFNα 为(191±19)ng/mL，随后血清中IFNα浓度保持稳定，6个月时IFNα浓度降低了29.28%(图2B)。

2.3 重组AAV6-IFNα 对肝功能指标ALT、AST的影响

注射AAV6-IFNα 6个月后小鼠血清中ALT 和AST 与对照PBS组和AAV6-GFP 组相对比没有区别(图2C，D)。

2.4 AAV6-IFNα体外显著抑制HBV的复制与表达

对各组HepG2.2.15细胞表达HBV DNA 检测显示，培养9 d后AAV6-IFNα 组抑制率[(空白组-实验组)/空白组×100%]可达40.13%(图3A);而AAV6-IFNα 组对培养上清中HBV DNA的抑制效果在感染3 d时即逐渐呈现，在感染9 d时抑制率可达62.93%(图3B)。同时测量培养上清中HBsAg 和HBeAg 含量变化，感染9 d后HBsAg 和HBeAg的抑制率分别为47.33%和37.49%(图3C，D)。HBsAg的抑制效果在感染3 d 以后逐渐呈现，而HBeAg的抑制效果在感染6 d 以后逐渐呈现。AAV6-IFNα 组与转染阳性对照组相比，对于HBV的复制和表达抑制效果更为明显，持续时间更长(P＜0.05)。

图2 AAV6 有效介导IFN 在体内外表达且不引起急性反应Fig2 Expression of IFN mediated effectively by AAV6 with no acute inflammatory reaction in vivo and in vitro

图3 AAV6-IFNα体外有效抑制HBV的复制与表达Fig3 The replication and expression of HBV inhibited by AAV-IFNα in vitro

2.5 AAV-IFN 抑制HepG2.2.15细胞增殖

AAV6-IFN 作用于HepG2.2.15细胞48、72 h后，可表现明显的抑制作用，抑制率分别为35%、69%，并呈现时间依赖关系(图4)。

图4 AAV6-IFNα 对细胞增殖的抑制作用Fig4 The proliferation of HepG2.2.15 cells inhibited by AAV6-IFNα

3 讨论

乙肝为高发传染病，目前治疗主要以干扰素及核苷类似物为主。干扰素的长期使用给患者带来痛苦和金钱负担。AAV 载体具有无致病性，低免疫原性，可介导外源基因长期表达等优点，已尝试用于多种疾病的治疗[3-4]。本实验尝试用AAV 载体来介导IFNα的长期表达，从而减少IFNα 注射次数，减轻乙肝患者的痛苦。

不同AAV 血清型对组织的感染率不同，用重组AAV 转染猕猴、小鼠和人的造血干细胞，发现AAV1 转染小鼠造血干细胞的能力强，而AAV6 转染人造血干细胞的能力强[6]，但采用AAV 对HepG2.2.15细胞的感染效率的评估鲜有报道。本实验中发现AAV6 对于HepG2.2.15细胞具有更强的感染性，更适合作为体外介导IFN 在HepG2.2.15细胞内表达的载体。

利用AAV6-IFNα 感染HepG2.2.15细胞和尾静脉注射小鼠的方法，在培养上清液和小鼠血清中均检测到IFNα的表达，说明利用AAV 载体介导HepG2.2.15细胞表达IFN 具有可行性。模型小鼠在长达6个月内均有IFN的表达，说明AAV6 载体可介导IFN 长期表达，体现了AAV6 作为载体的优越性。同时实验还对AAV6-IFN 安全性进行了检测，注射AAV6-IFN 小鼠的血清中反应肝细胞损伤的指标ALT 和AST 变化均与对照组没有显著区别。

体外AAV6-IFNα 感染HepG2.2.15细胞，发现表达的内源性IFNα 对HBV DNA、HBsAg 和HBeAg均有显著的抑制作用，抑制率可达50%以上，与阳性对照质粒pAAV-IFN 转染组相比，AAV6-IFNα 组抑制时间更长效果更显著。

AAV6-IFNα 能显著抑制HepG2.2.15细胞的增殖，并有时间依赖性，这可能是AAV6-IFNα 抑制HepG2.2.15细胞HBV 复制与表达的原因。因此，AAV6-IFNα是一种潜在的抗HBV 药物。但是还需要进一步将AAV6-IFN 在乙型肝炎小鼠模型上进行抗病毒效果的评估，观察其体内抑制HBV的复制和表达的能力及机制，本研究为体内实验奠定坚实的基础。

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