细胞外基质蛋白SRPX2促进HUVECs血管生成能力

樊江浩，刘揆亮，周 跃，吴 静*

(1.兰州大学第一临床医学院 消化内科，甘肃 兰州730000;2.首都医科大学附属北京世纪坛医院消化内科，北京100038)

肿瘤新生血管生成是肿瘤发展的一个重要环节，近年研究发现细胞外基质(extracellular matrix，ECM)中的各种蛋白多糖在肿瘤血管生成中发挥重要作用[1]。SRPX2是近年新发现的一种硫酸软骨素蛋白多糖，研究发现在小鼠t.End.1V 内皮细胞、人肺微血管内皮细胞和人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)均有SRPX2表达，沉默SRPX2 可以抑制小鼠t.End.1V内皮细胞迁移及早期出芽的形成，提示其参与调节内皮细胞迁移和管腔形成[2]，但尚不清楚在人体中SRPX2是否具有类似作用。本研究通过观察SRPX2对HUVECs 体外增殖、迁移和管腔形成能力的影响，明确其是否具有促进HUVECs血管生成能力的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂:Lipofectamine 2000(Invitrogen 公司);Opti-MEM I 还原型血清培养基(Gibco 公司);SRPX2抗体(兔抗人多克隆抗体，1 ∶500，Novus 公司);β-actin(小鼠抗人单克隆抗体)、二抗(辣根酶标记山羊抗小鼠IgG 和辣根酶标记山羊抗兔IgG)(1∶2 000，中杉金桥公司);ECL 化学发光试剂(北京普利莱基因技术有限公司);CCK-8 试剂(日本同仁公司);Matrigel 胶(BD 公司);Transwell 小室(Corning 公司)。

1.1.2 细胞:HUVECs 和HEK293T细胞系(北京协和细胞资源中心)。

1.2 方法

1.2.1 条件培养基的制备:用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM 培养基在37℃、5% CO2条件下分别培养HUVECs 及HEK293T细胞，当细胞处于对数增殖期时进行传代。pcDNA3.1-SRPX2 质粒按此前方法构建[3]。将处于对数增殖期的HEK293T细胞接种于6孔板中。待细胞汇合率为50%～60%时进行转染，质粒(μg)∶lipo2000(μL)=1∶2，各加入100 μL Opti-MEM I 稀释，混匀，室温静置5 min，将混合液均匀滴入6孔板中。实验分为3组:转染组(转染pcDNA3.1-SRPX2 质粒)、阴性对照组(转染空载的pcDNA3.1 质粒)和空白对照组(未添加质粒)。按上述条件完成转染后，弃去旧培养基，换做无血清的DMEM 培养基，放入培养箱培养，分别于24 和48 h时间点收集细胞培养上清液，混匀后1 200 r/min 离心10 min，过滤，分别得到转染组、阴性对照组和空白对照组HEK293T细胞的SRPX2条件培养基备用。

1.2.2 Western blot检测:配制8%的SDS-PAGE 分离胶及浓缩胶，以每孔20 μg 蛋白样品上样电泳，湿转到PVDF膜上，用5%的BSA 封闭2 h后，分别与SRPX2 及β-actin 一抗4℃孵育过夜，洗膜后分别孵育二抗，室温孵育2 h，TBST 洗膜30 min，膜表面滴加ECL 化学发光试剂，生物分子成像仪中曝光显影。

1.2.3 CCK-8 实验:将处于对数增殖期的HUVECs用胰蛋白酶消化，离心，用含胎牛血清体积分数10%的各组条件培养基调整细胞为5×104个/mL，加入96孔板中，100 μL/孔，放入培养箱中分别培养24、48 和72 h后，加入含10% CCK-8 试剂的DMEM完全培养基，放入培养箱孵育4 h，酶标仪检测吸光度(A450)。

1.2.4 Matrigel 管腔形成实验:96孔板加入4℃过夜液化的Matrigel 胶，50 μL/孔，轻轻摇匀铺于培养板底部，置于37℃培养箱中孵育1～2 h，待Matrigel胶凝固后，用含胎牛血清体积分数10%的各组条件培养基调整细胞为5×105个/mL，加入已铺好胶的孔中，100 μL/孔，37℃、5% CO2条件下培养6 h，200倍相差显微镜下观察，计数管腔样结构分支点数量。

1.2.5 细胞划痕实验:取处于对数增殖期的HUVECs，用胰蛋白酶消化吹打使细胞成单细胞悬液，调整细胞为1×105个/mL，接种于提前画好标记线的6孔板中，2 mL/孔，放入37℃、5% CO2条件下培养，待细胞完全贴壁后，用无菌枪头垂直标记线轻轻画出一条划痕，用PBS 洗去被划掉的细胞，分别加入含胎牛血清体积分数为10%的各组条件培养基继续培养，分别于0、6和12 h时间点在倒置显微镜下拍照，用Image-Pro Plus 6.0 软件分析图片，计算6和12 h时的细胞迁移距离。

1.2.6 Transwell 实验:将Transwell 小室置于24孔板中，下室加入上述转染48 h后，含胎牛血清体积分数0.5%的HEK293T细胞悬液500 μL/孔，细胞密度为2×105个/mL;上室加入含胎牛血清体积分数0.5%的HUVECs 悬液100 μL/孔，细胞密度1×105个/mL。放入培养箱中培养16 h后，弃去小室上下培养基，PBS 冲洗，无水甲醇固定，结晶紫染色后用棉签轻轻刮去未穿膜的细胞，PBS 冲洗后室温晾干，置于倒置显微镜下，随机选取5个视野计数穿膜细胞，取其平均值。

1.3 统计学分析

采用SPSS 17.0 统计学软件进行统计学分析。本研究检测指标的数据资料经W 检验呈正态分布，组间均数经F 检验方差齐，结果以均数±标准差(±s)表示。各项指标均采用方差分析，采用双侧检验法。

2 结果

2.1 SRPX2 在HEK293T细胞中的表达

转染HEK293T细胞48 h后，检测到转染组细胞裂解液中有SRPX2 蛋白表达(图1)。

图1 重组质粒转染后SRPX2 在HEK293T细胞的Western blot检测结果Fig1 Expression levels of SRPX2 were detected by Western blot after construction vetor transfected into HEK293T cells

2.2 CCK-8 细胞增殖实验

细胞培养24、48 和72 h后，各组间吸光度(A450)值均无差异(图2)。

图2 各组细胞增殖能力Fig2 Proliferation of HUVECs of each groups(±s，n=6)

2.3 Matrigel 管腔形成实验

转染组管腔样结构分支点数为(97±4)个/视野，明显多于阴性对照组(57±3)个/视野和空白对照组(54±3)个/视野(P＜0.05)(图3)。

2.4 细胞划痕实验

6 h后转染组细胞迁移的距离显著高于阴性对照组和空白对照组，分别为(90±6)、(37±7)和(36±4)μm(P＜0.05);划痕12 h后细胞伤口愈合更加明显，迁移距离分别为(135±5)、(65±8)和(63±4)μm (P＜0.05)。

2.5 Transwell 迁移实验

转染组迁移细胞数明显多于阴性对照组和空白对照组，分别为(549±10)、(334±11)和(329±12)个/视野(P＜0.05)(图4)。

图3 各组HUVECs 形成管腔样结构分支点数Fig3 Total branch point of capillary tubes of each groups(×200)

图4 各组HUVECs 迁移细胞数Fig4 Number of migrating cells of each groups(×200)

3 讨论

肿瘤血管生成是指在已有血管基础上新血管的形成，包括静止状态内皮细胞的激活、基底膜与ECM的蛋白降解、细胞连接的断裂、内皮细胞增殖、趋化性迁移入周围基质和新管腔形成[4]。ECM 在肿瘤血管生成中发挥重要调节作用。含糖胺聚糖(glycosaminocan，GAG)链的蛋白多糖(proteoglycan，PG)是ECM 中主要的非胶原糖蛋白成分之一，包括硫酸肝素蛋白多糖(heparan sulfate proteoglycan，HSPG)与硫酸软骨素蛋白多糖(chondroitin sulphate proteoglycan，CSPG)，均可与细胞表面受体及多种促血管生成因子结合，参与肿瘤血管生成。SRPX2 蛋白是一种新发现的CSPG[5]，在胃癌、肺癌、间皮瘤和神经胶质瘤等多种恶性肿瘤高表达，并与肿瘤恶性程度及患者的预后相关[6]。SRPX2 还可能具有促血管生成作用。SRPX2 在HUVECs 中高表达[6]，在血管生成激活状态下的小鼠t.End.1V内皮细胞中，用siRNA 沉默SRPX2 基因表达可特异性抑制内皮细胞迁移，抑制血管出芽形成。SRPX2上游的转录后抑制性调节因子具有抑制肿瘤新生血管生成的作用[7]。在转染了pcDNA3.1-SRPX2 质粒的HEK293T细胞的培养基中检测到有SRPX2 存在，证实SRPX2是一种分泌性蛋白，且来源于高表达SRPX2的HEK293T细胞的条件培养基可以增强胃癌细胞系SUN-16的迁移能力[6]。本研究采用类似方法提取了HEK293T条件培养基，观察SRPX2对HUVECs 体外血管生成能力的影响。经转染SRPX2高表达质粒的HEK293T细胞的条件培养基可显著促进HUVECs的迁移能力及管腔形成能力，证实其可能具有促进血管生成的作用。转染HEK293T细胞提高其SRPX2 水平并不能促进其增殖[6]。与之相符，SRPX2 高表达的HEK293T细胞的条件培养基不能促进HUVECs增殖。

尿激酶型纤溶酶原激活物(urokinase-type plasminogen activator receptor，uPAR)可以调节细胞外蛋白水解、整合素激活和信号传导[8]。SRPX2 作为uPAR的配体，在血管生成激活状态下的小鼠t.End.1V 内皮细胞可与血管内uPAR 直接结合形成SRPX2/uPAR 复合体，参与血管生成过程[2]。黏着斑激酶(focal adhesion kinase，FAK)作为一种胞质蛋白激酶，可以通过与生长因子和整合素结合被激活，调节细胞黏附和迁移[9]，SRPX2 高表达可激活FAK信号通路增强细胞的迁移和黏附能力[6]。研究报道SRPX2 可能通过与uPAR 结合后激活FAK通路发挥作用[10]，推测其在HUVECs 中也可能具有类似作用。这还需要进一步的研究证实。

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