人胰岛素抑制大鼠肝细胞系BRL-3A凋亡且促增殖

王改平，陈莎莎，李晓芳，杨 婧，赵卫明，常翠芳，徐存拴

(1.河南师范大学 生命科学学院;2.河南省-科技部共建细胞分化调控国家重点实验室培育基地，河南 新乡453007)

胰岛素是一种多功能的蛋白质激素，具有刺激DNA 和蛋白质合成、促进细胞生长的作用。研究发现，胰岛素能有效地促进脂肪细胞3T3-F442A的生成[1]。此外，胰岛素还可促进体外培养的人膀胱癌细胞系(T24)和原代大鼠卵泡膜间质细胞的增殖[2-3]。原代肝细胞的体外培养存在生长条件苛刻、增殖和传代困难等缺点[4]，一定程度上限制了其在肝脏功能研究上的应用。研究者尝试加入胰岛素、地塞米松等生长因子以促进原代肝细胞的存活与生长[5]。BRL-3A是来自大鼠肝脏的肝细胞系，并在肝细胞研究中被广泛用作正常肝细胞[6]，目前还没有关于人胰岛素对BRL-3A的体外作用研究。因此，本研究将不同浓度的人胰岛素作用于BRL-3A细胞，并通过MTT、流式细胞术和qRT-PCR 等方法检测人胰岛素对肝细胞系的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

大鼠BRL-3A 肝细胞系(中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心);DMEM 培养基、100 μg/mL青霉素、100 μg/mL 链霉素和Trizol(Invitrogen 公司);胎牛血清(杭州天杭生物科技有限公司);诺和灵R 人胰岛素(丹麦诺和诺德公司);MTT 和二甲基亚砜(Geneview 公司);DNase Ⅰ和AMV 反转录试剂盒(Promega 公司);qPCR引物(由北京三博远志生物公司合成)。

1.2 方法

1.2.1 BRL-3A细胞的培养:BRL-3A细胞在含10%小牛血清的DMEM 完全培养基(含青霉素100 μg/mL，链霉素100 μg/mL)中，于37℃、5%CO2、饱和湿度条件下进行培养。

1.2.2 MTT 比色法检测BRL-3A细胞活性:取第3代BRL-3A细胞接种于96孔板(3 000个细胞/孔，0.2 mL 培养基)，给予诺和灵R 人胰岛素(human insulin，HI)梯度处理，终质量浓度分别为0、10、100、500 和1 000 nmol/L，每个梯度设置3 孔重复，孵育12 h后，加入10 μL MTT，37℃、5% CO2培养箱中继续孵育4 h，吸掉上清，每孔加入100 μL 二甲基亚砜(DMSO)，轻轻振荡混匀10 min，使其充分溶解由活细胞产生的甲瓒晶体，于酶标仪检测490 nm 处各孔吸光度A值。按上述操作检测胰岛素作用第1、2、3、4 和5 天的细胞增殖情况。

1.2.3 流式细胞仪分析:取对数期增殖BRL-3A细胞接种于24孔板，细胞调整为2×104个/孔，给予500 nmol/L人胰岛素处理，同时设置未处理对照组，每个样品设置6个孔，并作3次重复，24 h后换液，处理3 d后，收集细胞，用预冷PBS 洗1次(1 000 r/min，4℃，10 min)，弃上清，于70%乙醇中－20℃固定过夜，然后，将样品离心(3 000 r/min，10 min，室温)，弃上清，沉淀用500 μL 预冷PBS 洗1次(3 000 r/min，10 min，室温)，弃上清，再用含0.1 mg/mL RNase A的PI 染色液(50 mg/L)重悬细胞，室温避光孵育15 min，300 目筛网过滤细胞，最后，流式细胞仪测定细胞周期分布情况。

用500 nmol/L人胰岛素处理3 天后，收集细胞，将细胞悬液转移至1.5 mL EP 管中离心(1 000 r/min，4℃，10 min)，用PBS 洗2次。每个样品中加入200 μL结合缓冲液重悬细胞，加入10 μL 染液FITC，室温避光孵育15 min，然后补加300 μL 结合缓冲液，加入10 μL 染液PI，室温避光孵育5 min，300 目筛网过滤细胞，最后，用流式细胞仪测定细胞凋亡情况。

1.2.4 qRT-PCR检测CCNA2、BAX、JUN 和MYC 基因的表达:根据GenBank 上大鼠CCNA2 (NM_053702)，BAX(NM_017059)，JUN(NM_021835.3)和MYC(NM_012603.2 )的mRNA 序列，利用Primer Premier 5.0 设计其qPCR引物。引物序列如下:CCNA2上游5'-CTTTTAGTGCCGCTGTCTCTTT-3'，下游5'-GCCCGCATACTGTTAGTGATGT-3';BAX 上游5'-TTTCATCCAGGATCGAGCAG-3'，下游5'-CAAAG TAGAAGAGGGCAACCAC-3';JUN 上游5'-GGCTGT TCATCTGTTTGTCTTCAT-3'，下 游5'-CCCTTTTCTT TACGGTCTCGGT-3';MYC 上游5'-CCCTACCCGCTC AACGACA-3'，下游5'-GCCTCTTTTCCACAGACACC A-3';按Trizol的操作说明分离、纯化BRL-3A细胞的总RNA。反转录前用DNaseⅠ37℃消化总RNA 30 min，以去除残留的基因组DNA 污染。用上述纯化的BRL-3A细胞RNA 为模板，按照AMV 反转录试剂盒操作说明进行反转录，得到cDNA 第一链。然后采用SYBR Green Ⅰ掺入的方法在Rotor Gene 3000(Corbett Robotics，CA)对基因CCNA2、BAX、JUN 和MYC 以及内参基因ACTB 分别进行PCR检测，从而计算出靶基因在胰岛素处理后的相对含量。PCR扩增反应条件为:95℃1 min，95℃15 s，60℃15 s，72℃30 s，40个循环[7]。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 人胰岛素对BRL-3A细胞增殖的影响

100nmol/L人胰岛素作用于BRL-3A细胞第4天时，实验组吸光度值开始高于对照组;当人胰岛素浓度为500 nmol/L，药物消耗量适中，且从第3 天开始，实验组吸光度值即显著高于对照组(P＜0.05或P＜0.01);而1 000 nmol/L人胰岛素处理后第1天，实验组吸光度值即极显著高于对照组(P＜0.01)(表1)，但因药物消耗量太大，本文选择500 nmol/L的浓度进行后续实验。

2.2 人胰岛素对BRL-3A细胞周期的影响

500nmol/L人胰岛素处理BRL-3A细胞3 d后，处于G0/G1期的细胞比例为64.16%±1.73%，显著低于对照组的68.16%±1.36%(P＜0.05)，而处于S期和G2/M期的细胞比例经过处理后开始增多(图1)。

2.3 人胰岛素对BRL-3A细胞凋亡的影响

用500nmol/L人胰岛素处理BRL-3A细胞3 d后，实验组的凋亡率为2.17%±0.36 %，对照组为2.97%±0.20%，处于早、晚期凋亡的细胞比例比对照显著降低(P＜0.05)(图2)。

2.4 人胰岛素对目的基因表达的影响

经500nmol/L人胰岛素作用后JUN 和MYC 无显著表达变化，BAX表达显著下调(P＜0.05)，而CCNA2表达显著上调(P＜0.05)(图3)。

表1 MTT法检测不同质量浓度人胰岛素对BRL-3A细胞增殖的影响Table1 Influence of human insulin on the proliferation of BRL-3A detected by MTT method(±s，n=3)

表1 MTT法检测不同质量浓度人胰岛素对BRL-3A细胞增殖的影响Table1 Influence of human insulin on the proliferation of BRL-3A detected by MTT method(±s，n=3)

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01 compared with control.

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图1 500 nmol/L人胰岛素(HI)处理对BRL-3A细胞周期的影响Fig1 Impact of 500 nmol/L human insulin on cell cycle progression in BRL-3A

图2 500 nmol/L人胰岛素(HI)处理对BRL-3A细胞凋亡的影响Fig2 Effect of 500 nmol/L human insulin on the apoptosis of BRL-3A cells

图3 qRT-PCR检测人胰岛素处理后4个目的基因的表达变化Fig3 Expression changes of four target genes after human insulin treatment were detected by qRT-PCR(±s，n=3)

3 讨论

通过体外细胞实验发现，胰岛素可能通过激活大鼠结肠平滑肌细胞(SMCs)的MAPK 通路中的ERK 途径，促进细胞增殖和抑制凋亡[8]。研究胰岛素对大鼠卵泡膜间质细胞的作用时发现，它能诱导该原代细胞增殖，并促进CDK4，CCND3 和PCNA 等蛋白的表达，而用mTOR 抑制剂-雷帕霉素处理后，参与细胞周期G1/S 转换的CCND1 和CCND3 等基因的mRNA表达受到抑制[3]。本研究选择500 nmol/L的人胰岛素处理BRL-3A细胞3 d后发现，处于G0/G1期的细胞比例与对照相比显著降低。通过qRT-PCR 方法继续检测发现，CCNA2基因与对照相比明显上调，却没有发现CCND1 和CCND3 基因的表达上调。CCNA2是编码细胞周期蛋白A2(CCNA2)的基因，CCNA2 可以在S期结合CDK2，在G2/M期结合CDK1，因此CCNA2 对S期和G2/M期的运转至关重要。CCNA2 基因过表达可以促进耳蜗神经祖细胞的增殖[9]。用RNAi 技术敲除人宫颈癌HeLa 细胞的CCNA2 基因后发现，细胞核被膜裂解明显延迟，细胞增殖受抑制[10]。以上结果表明，qRT-PCR检测结果与流式结果具有一致性，CCNA2 可能在人胰岛素处理后参与促进BRL-3A细胞周期的转换，降低G0/G1期细胞的比例，从而促进细胞增殖。

细胞凋亡是指在特定时空发生的、受机体严密调控的细胞自杀现象，是一种基因控制的细胞自主性死亡过程。BAX是与凋亡密切相关的基因，当BAX 过量时，形成BAX 同源二聚体，细胞则趋向凋亡[11]。研究表明，戊地昔布可通过增高BAX表达诱导人乳腺癌MCF-7 细胞的凋亡[12]。此外，胰岛素能通过抑制BAX 基因的表达而抑制神经胶质C6细胞凋亡[13]。与上述研究结果一致，本文的qRTPCR检测结果表明，BAX 基因在500 nmol/L人胰岛素处理后的BRL-3A细胞中明显下调，只有对照的57.43%。因此，大鼠BRL-3A细胞的增殖可能与BAX 基因的下调表达有关。

总之，人胰岛素对大鼠肝细胞BRL-3A 有促进增殖、抑制凋亡的作用，并伴随着CCNA2 基因的表达上调和BAX 基因的表达下调。由此推断，抑制凋亡发生和诱导细胞增殖可能是胰岛素促进BRL-3A细胞增殖的重要机制，然而细胞增殖是非常复杂的过程，涉及的信号通路和具体作用机制还需进一步研究。

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