骨髓间充质干细胞可分化为溃疡性结肠炎大鼠结肠组织上皮细胞

张夏梦，寿折星，陈望隆，张继红，马泽洪，任俊红

(1.宜昌市第二人民医院 中西医结合科，湖北 宜昌443000;2.华中科技大学同济医学院附属协和医院中西医结合科，湖北 武汉430022;3.三峡大学 医学院，湖北 宜昌443000)

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)是一类病因尚未完全明确的肠道非特异性炎症反应性疾病。骨髓细胞是唯一的胃肠道以外来源的有助于肠上皮再生的细胞，其中骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一种具有多分化潜能的细胞，在特定条件下能诱导分化形成各种非造血组织[1-2]，且具有很强的免疫调节作用[3]。本实验通过大鼠UC模型，旨在研究MSCs 向结肠黏膜上皮细胞的分化情况，并通过检测MSCs 移植对炎性因子白介素-4(interleukin-4，IL-4)及核因子-κB(nuclear factorκB，NF-κB)表达的影响，为MSCs 移植治疗炎性肠病提供理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

2，4，6-三硝基苯磺酸(Sigma 公司，P2297);大鼠SRY DNA 原位荧光杂交染色系统(天津市灏洋生物公司，RAT2009BIO);兔抗大鼠CK20 单克隆抗体(Abcam 公司，ab76126);NF-κB p65 多克隆抗体(Santa Cruz 公司，sc-8000);浓缩型DAB 显色剂(Bioss 公司，C-0010);羊抗小鼠IgG、SABC-Cy3 试剂盒(武汉博士德公司);SYBR Green 定量PCR 试剂盒(Roche 公司);大鼠白介素4 (IL-4)酶联免疫吸附测定试剂盒(伊莱瑞特公司，E-EL-R0014)。

1.2 实验动物

SPF级SD大鼠，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供，实验动物质量合格证SCKY(鄂)2008-0005，No:4200696100;实验动物设施使用证明SYXK(鄂)2010-0057，No:00116132。3～4周龄雄性大鼠5只，体质量(160±20)g，用于制备MSCs;6～8周龄雌性大鼠30只，体质量(250±20)g，用于分组实验。

1.3 MSCs的分离、传代与鉴定

收集雄性大鼠骨髓细胞，置于CO2细胞培养箱中培养。传代培养，取第3代细胞留用。采用荧光标记的CD29、CD90、CD45 及CD11b，用流式细胞学方法鉴定MSCs。

1.4 UC模型制备及干预

1.4.1 模型制备:用三硝基苯磺酸(TNBS)/乙醇复合法局部灌肠法建立溃疡性结肠炎大鼠模型。

1.4.2 分组:将雌性大鼠随机分为:正常组、模型组、MSCs组，每组10只。模型组和MSCs组建立大鼠UC模型。24 h后，正常组和模型组经尾静脉注入0.9% 氯化钠溶液1 mL;MSCs组经尾静脉注入1×106MSC s 悬液1 mL。

1.4.3 取材:建立模型后，观察大鼠日常活动、进食以及腹泻和黏液脓血便情况。2周后，留取每只大鼠远端结肠组织长约8 cm，比较各组大鼠结肠组织病理学变化。取病变明显的结肠组织标本。

1.5 荧光原位杂交结合免疫荧光染色

1.5.1 Y染色体DNA 荧光原位杂:交采用荧光原位杂交(SRY FISH)及DAPI 复染技术检测，按照大鼠SRY FISH 试剂盒说明书操作以及按DAPI 说明书步骤染色。

1.5.2 免疫荧光染色检测CK20表达:结肠组织连续切片、拷片、脱蜡复水;抗原修复后，孵育，封闭，滴加兔抗大鼠CK20 单克隆抗体，4℃过夜;滴加生物素化羊抗大鼠抗体，孵育;加SABC-CY3，封片;滴加DAPI 避光孵育，核复染;用含抗荧光淬灭剂的封片液封片。

1.5.3 采集荧光图像:各组结肠组织切片按以上步骤处理后，在荧光显微镜下，FAM 激发波长λ=510 nm，观察采集位于细胞核内的黄绿色荧光图像。DAPI 激发波长λ= 360 nm，观察采集细胞核内的蓝色荧光图像。CY 3 激发波长λ = 550 nm，观察采集位于细胞质的红色荧光。应用Imagepro3Dss.1 图像处理软件进行图片扫描、取图、图像叠加。

1.6 RT-PCR 技术检测CK20、NF-κB、IL-4的表达

按照TRIzol 试剂盒说明书提取结肠组织细胞总RNA，反转录成cDNA。取2 μL 转录产物作模板，引物序列如下:β-actin 正向:5'-CACGATGGA GGGGCCGGACTCATC-3'，β-actin 反向:5'-TAAAG ACCTCTATGCCAACACAGT-3'，扩增长度240 bp;Rat CK20 正向:5'-ATGCGGATAACTGTGGAAGC-3'，Rat CK20 反 向:5'-CCTCCACGTTGACATTGTTG-3'，扩增长度187 bp;Rat NF-κB 正向:5'-CCGTGAGGC TGTTTGGTTTG-3'，Rat NF-κB 反 向:5'-GGTCTGCC CTCCTGACTCTA-3'，扩增长度92 bp;Rat IL-4 正向:5'-GTACCAGACGTCCTTACGGC-3'，Rat IL-4 反向:5'-CTCAGTTCACCGAGAACCCC-3'，扩增长度143 bp;反应条件为:94℃4 min，94℃30 s，54℃30 s，72℃25 s;30个循环，72℃4 min，4℃4 min。采用2－△△Ct方法分析各组相对基因表达差异。

1.7 Westen blot检测NF-κB蛋白的表达

取－80℃低温保存的结肠组织，测定蛋白浓度，制成含蛋白量相等的样品，经电泳、转膜、封闭，加入一抗，4℃孵育过夜;TBS 洗膜3次，加入辣根过氧化物酶耦联的二抗室温孵育2 h，ECL 显色剂显色，用Bio Rad 密度扫描仪进行扫描，测定各蛋白的相对吸光度值。

1.8 ELISA 检测结肠组织中IL-4 含量

将组织样品称重，按组织质量∶PBS 体积=1∶9的比例用预冷的PBS 将组织样品匀浆，4℃10 000 r/min 离心10 min，小心吸取上清检测。ELISA 实验步骤参照说明书进行，采用酶标仪测A值。

1.9 统计学分析

采用SPSS17.0 软件进行统计学数据分析，计量资料数据以均数±标准差(±s)表示，采用单因素方差分析，两两比较用LSD 法。

2 结果

2.1 MSC 形态学特征及鉴定

接种24 h后可见散在分布的贴壁细胞，为短梭形、椭圆形、长梭形;15 d后，细胞的体积增大，呈旋涡状排列。经消化、传代后，第3代MSCs 在24 h 内即可完全贴壁、伸展，呈纺锤状形态。第3代MSCs表达CD29 和CD90，不表达CD45 和CD11b，可判定最终培养的细胞为MSCs(图1，2)。

2.2 造模临床观察

模型组和MSCs组大鼠大部分出现竖毛、活动减少、饮食减少，并出现稀便和黏液脓血便，说明UC造模成功。

图1 第3代MSCsFig1 The MSCs of passage 3(×200)

图2 F3代MSCs 流式细胞仪检测结果Fig2 Flow cytometry analysis of passage 3 MSCs

2.3 组织病理观察

模型组大鼠结肠有明显的充血水肿，黏膜结构异常，伴坏死和糜烂，部分黏膜上皮损伤脱落，杯状细胞减少，炎性细胞侵袭全层;MSCs组大鼠结肠黏膜结构尚完整，上皮轻度损伤，杯状细胞增多，充血水肿较轻，溃疡较浅表，炎性细胞侵袭减少(图3)。

2.4 Y染色体和CK20 双阳性细胞表达

结肠组织切片可见位于细胞质的红色荧光，即CK20 阳性，主要分布于结肠黏膜上皮细胞;MSCs组结肠组织切片可蓝色荧光的细胞核内有绿色荧光亮点，即Y染色体SRY FISH 阳性表达，在结肠组织肠黏膜上皮和固有层均有分布。部分Y染色体阳性细胞，可见位于细胞质的红色荧光，即Y染色体和CK20 双阳性细胞表达(图4)。

2.5 RT-PCR检测结果

模型组及MSCs组CK20表达较正常组增高P＜0.01)，MSCs组表达高于模型组(P＜0.01)，模型组和MSCs组NF-κB表达高于正常组，IL-4表达低于正常组(P＜0.01);MSCs组NF-κB表达低于模型组，IL-4表达高于模型组(P＜0.01)(表1)。

图3 各组大鼠病变结肠组织病理观察Fig3 Pathologic changes of the colonic tissues of rats in respective experimental group(×100)

图4 SRY FISH 和CK20 免疫荧光染色Fig4 Fluorescent Y chromosome in situ hybridization and immunofluorescent staining of CK20(×400)

表1 各组CK20、NF-κB、IL-4 mRNA 相对表达结果Table1 The mRNA expression of CK20，NF-κB and IL-4 in different groups (±s，n=10)

表1 各组CK20、NF-κB、IL-4 mRNA 相对表达结果Table1 The mRNA expression of CK20，NF-κB and IL-4 in different groups (±s，n=10)

*P＜0.01 compared with normal control group;#P＜0.01 compared with model group.

group CK20 NF-κB IL-4 normal control 1.060±0.193 0.981±0.130 1.03 5±0.104 model 1.758±0.320* 3.546±0.593* 0.178±0.038*MSCs 2.564±0.429# 1.758±0.221# 0.518±0.029#

2.6 Westen blot检测结果

模型组NF-κB表达显著高于正常组(P＜0.01)，MSCs 干预组NF-κB表达显著下降(P＜0.01)，但仍高于正常组(P＜0.01)(图5)。

2.7 ELISA 检测结果

模型组及MSCs组IL-4的水平较正常组显著减低(P＜0.01)，而MSCs组中IL-4的水平比模型组升高(P＜0.01)(图6)。

图5 Western blot检测NF-κB蛋白的表达Fig5 The expression of NF-κB proteins detected by Western blot(±s，n=10)

图6 ELISA 检测IL-4的表达Fig6 The expression of IL-4 detected by ELISA(±s，n=10)

3 讨论

结肠黏膜上皮细胞是维持肠道功能的结构基础，UC 常常伴结肠黏膜上皮细胞凋亡加速[4]，且由于肠道内产生大量炎性细胞因子及介质，加剧损伤肠黏膜屏障功能[5]。因此抑制肠道炎性反应、修复上皮细胞从而改善肠上皮屏障功能是治疗UC的新思路。

MSCs 有提高受损上皮再生的能力，可能是上皮细胞再生的来源[6]。有研究证明MSCs 能通过分化为上皮细胞促进损伤气道黏膜的修复[7]。本实验检测到雌性大鼠结肠组织中出现带Y染色体标志的雄性供体来源的细胞，主要分布在结肠黏膜上皮及固有层。同时检测大鼠结肠组织上皮细胞表型特征标志物细胞角蛋白20(CK20)，CK20表达范围特异，能在胃肠道组织的上皮细胞中表达，可作为检测结肠黏膜上皮细胞的特征性指标。证明结肠组织部分上皮细胞是雄性供体来源的MSCs 分化而成的新生上皮细胞。

免疫异常是UC 发病的重要因素[8]。MSCs 具有很强的免疫调节能力，可以抑制T细胞、B 细胞增殖、影响树突细胞的成熟及功能[9]。NF-κB 和IL-4与UC的发生发展密切相关。本研究表明，MSCs 能通过调节NF-κB 和IL-4的表达，改善肠道的炎性反应状态，另外通过分化为结肠组织上皮细胞，促进黏膜上皮的修复。

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