细针穿刺细胞块的制作和免疫细胞化学在乳腺癌诊断和术前化疗中的意义

彭芳 ，王建 ，张功亮 ，钟斌

(1、赣州市人民医院病理科，江西 赣州 341000；2、赣南医学院第一附属医院药剂科，江西 赣州 341000)

乳腺癌是严重危害女性健康的恶性肿瘤，早期发现并治疗乳腺癌具有很大意义。细针穿刺细胞学检查具有准确、快速、方便和创伤小的特点，广泛用于临床初步判断肿瘤的良恶性。特别在乳腺肿瘤方面，因乳腺肿瘤位置表浅，操作方便，不容易损伤血管神经，已成为术前判断乳腺肿瘤良恶性的主要手段[1-3]。然而细针穿刺传统涂片由于涂片厚，细胞重叠，厚薄不均，细胞结构、背景不清晰，细胞量少，特别是不宜进行ER、PR、C-erbB-2和Ki-67这些重要内分泌标记物的测定而有一定的局限性。本研究探索一种既操作方便又能准确反应患者内分泌情况的方法。

我们对40例乳腺癌患者进行细针穿刺细胞学检测，在常规涂片瑞氏染色做出细胞学诊断后剩余部分细胞制成细胞蜡块，行HE染色及免疫细胞化学方法检测乳腺癌靶向治疗相关的ER、PR、C-erbB-2和Ki-67的表达情况，并与术后组织切片免疫组化结果进行对照研究，以此探讨穿刺细胞块的制作和免疫细胞化学在乳腺癌诊断和术前化疗中的意义。

1 材料与方法

1.1 临床资料 选择2013年1月-2015年1月，在我院有手术病理学结果并在术前做细针穿刺细胞学并制作细胞块的乳腺癌患者40例。患者均为女性，年龄26~77岁，平均年龄44岁，左侧病灶28例，右侧病灶12例，肿物大小0.6cm~7cm。所有病例手术前均无放疗、化疗和激素治疗病史。

1.2 细胞块的制备 对乳腺肿块的患者，穿刺前检查肿物位置、大小、硬度、活动度和边界，碘伏消毒，左手固定肿物，右手用10ml普通注射器进行穿刺，快速穿刺入肿物，保持5~8ml负压，通过快速抽提8~10次，对肿物进行反复切割，同时借助针管内的负压将标本吸入穿刺针内，涂片2张，做瑞氏染色细胞学检查。剩余标本直接打在玻片上并聚拢，滴2次95%的酒精覆盖组织自然风干，酒精和标本中的部分血液有使其凝固和保持部分组织结构的作用。此时组织已经粘附在玻片上，组织和玻片直接放入10%的中性福尔马林中固定8h后常规包埋、制片。

1.3 免疫细胞化学方法 免疫组化试剂一抗采用福州迈新生物技术开发公司生产的ER、PR、C-erbB-2、Ki-67。检测系统也采用福建迈新公司的Elivision试剂盒。细胞块石蜡切片厚度3~4μm，60℃烤箱烤片1h，梯度二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，蒸馏水浸泡5min，3%过氧化氢室温孵育10min阻断内源性过氧化酶的活性，PBS液冲洗，高压锅抗原修复，自然冷却至室温。加入二步法Elivision试剂盒中试剂A，室温孵育20min，PBS冲洗3次，每次5min，加入试剂盒中试剂B，室温下孵育30min，PBS冲洗3次，每次5min。镜下控制DAB显色，蒸馏水冲洗终止反应。苏木素复染，盐酸酒精分化，自来水冲洗返蓝，脱水，透明，中性树胶封片，每次均做阳性对照及PBS代替一抗做阴性对照。

1.4 结果判定 浸润性乳腺癌ER PR阳性定位于细胞核，以细胞核出现棕黄色颗粒者为阳性，若细胞膜或细胞质出现棕黄色颗粒视为阴性。阳性细胞数占所有肿瘤细胞数的比例称为阳性率，即在高倍镜(400×)下借助镜标尺计数阳性细胞数和肿瘤细胞数，连续观察10个高倍视野，计数阳性细胞比例=阳性细胞数之和/肿瘤细胞数之和×100%。评分采用ASCO/CAP发表的检测指南以1%为阳性界值判断肿瘤细胞阳性率并参考Allred评分法，阳性率评分如下：阴性记O分，A11red评分法将 1%~10%评为（+），11%~33%评为（++），>33%评为（+++）；染色强度评分如下：阴性(高倍镜无任何细胞核染色)O分，弱(仅在高倍镜能分辨细胞核染色)1分，中度 (低倍镜能分辨细胞核染色)2分，强(低倍镜明显细胞核染色)3分。

HER2阳性定位于细胞膜，评分采用2013年ASCO/CAP发布的最新指南：阴性：未观察到染色或≤10%肿瘤细胞出现不完整、微弱或难以察觉的细胞膜染色。>10%肿瘤细胞出现不完整、微弱或难以察觉的细胞膜染色为（1+）。>10%肿瘤细胞出现不完整和(或)微弱／中度细胞膜染色或≤10%肿瘤细胞出现完整的细胞膜强阳性染色为（2+）。>10%肿瘤细胞出现完整的细胞膜强染色为（3+）。

Ki-67阳性定位于细胞核，计数阳性比例高的区域阳性细胞的百分比。

2 结果

2.1 细胞块HE及免疫染色结果 穿刺细胞学检查获取的细胞量较多，并含有微小颗粒，保留部分组织结构，可制备高质量的细胞块(图1)，有助于做出细胞病理诊断。免疫细胞化学方法显示细胞分布较均匀，阳性着色部位准确，背景清晰 （图2~图4）。

图1 细胞块HE染色（×200）

图2 细胞块ER（×400）

图3 细胞块PR染色（×200）

图 4 细胞块HER-2（ ×400）

2.2 细胞块与术后病理标本免疫化学对比结果40例细胞块免疫细胞化学结果：ER阳性28例 （阳性率 70%）；PR阳性 27例 （阳性率 67.5%）；C-erbB-2阳性：1+有4例（阳性率 10%），2+有5例（阳性率12.5%），3+有3例 （阳性67.5%）；Ki67阳性平均值35%。术后病理免疫组织化学结果为：ER阳性30例 （阳性率 75%）；PR阳性 29例 （阳性率72.5%）；C-erbB-2阳性：1+有 5例（阳性率 12.5%），2+有 5例 （阳性率 12.5%），3+有 3例 （阳性率67.5%）；Ki67阳性平均值38%。细胞块和术后病理标本免疫化学结果无明显差异，其结果见表1。

表1 细胞块与术后病理标本免疫化学结果

3 讨论

细针穿刺细胞学检查在初步诊断乳腺肿块的良恶性是一种有效手段。乳腺癌如果早期诊断，能够选择最有效的治疗方法，而良性的肿瘤，病人可以不用再受手术治疗的痛苦[1-4]。细针穿刺细胞学检查相对外科手术和巴德针穿刺是一种非侵袭性、痛苦小、不需要麻醉、感染机率小的诊断方法。这些标本不仅可用于做细胞学的诊断，而且可以用于免疫细胞学检查，给诊断和治疗提供有用的信息。

随着医疗水平和人们生活质量的提高，乳腺癌的治疗越来越规范，术前辅助化疗成为重要的治疗方法之一，辅助化疗前要检测ER、PR、CerbB-2、Ki67 的表达情况[2，3]，了解乳腺癌患者内分泌情况及恶性程度和预后，才能使临床医生制定出合理正确的治疗方案。目前诊断乳腺癌和术前检测以上重要生物学指标的方法有细针穿刺细胞学涂片法、粗针穿刺和切取活检三种方法[4-6]。细胞学涂片法有时因细胞重叠，结构不清，固定不及时而使免疫细胞化学显色时，背景不清晰，阳性反应弥散，非特异性着色，使待检抗原在定性、定位准确率方面不够理想，并且不能连续切片及永久性保留标本[4-10]。粗针活检和切除活检，操作麻烦、病人痛苦大、费用高，有时可出现出血、感染等并发症。细针穿刺吸取细胞学检查作为乳腺肿瘤术前或新辅助化疗前定性诊断的重要手段之一，具有与空心针活检、病理检查相类似的作用，其诊断价值已经得到普遍的承认[4-7，11-15]。

我们用10ml细针穿刺乳腺癌组织，制备的细胞块能够弥补以上方法的不足之处，获得标本量多，通常含有微小组织或颗粒，在涂片中保留丁部分组织结构特点，更有利于做出准确的细胞病理诊断，为制备高质量的细胞块提供了保障。并且细胞采集量多，分布适中，免疫细胞化学染色效果佳，细胞块技术最大特点是可以连续切片，能为乳腺癌术前辅助化疗做多种抗体染色、原位杂交等以满足诊断需要，并能长期保留标本。

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