动态比浊快速鉴定金黄色葡萄球菌方法建立及应用评价

刘涛 ，黄艳芳 ，伍晨辉 ，宋秋月 ，陈开森

(1、南昌大学第一附属医院检验科，江西 南昌 330006；2、南昌大学公共卫生学院检验班学生，江西 南昌 330006)

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是临床常见的致病菌，常导致院内感染和社区感染[1，2]，甚至食物中毒[3]，具有较高的发病率和病死率。研究资料表明金黄色葡萄球菌是最为常见的革兰阳性感染菌，特别是近年来随着耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的扩散，导致金黄色葡萄球菌感染的预防、治疗更加棘手[4]。如何有效、快速、经济地鉴别金黄色葡萄球菌具有重要的实际意义。目前大部分临床实验室鉴别金黄色葡萄球菌常采用商品化试剂及配套仪器，由于成本高，部分实验室开展具有一定的困难。金黄色葡萄球菌有别于其它细菌的主要特点是其可产生血浆凝固酶（Plasma coagulase），故根据细菌的该生物特征能较好地鉴定金黄色葡萄球菌[5]。目前，部分实验室，特别是基层实验室常采用血浆凝固酶法检测金黄色葡萄球菌，而常用的方法是试管法。然而，部分金黄色葡萄球菌凝固酶产酶量低，短时间内不易肉眼观察，而常被认为假阴性；此外，少数菌株可产生葡激酶（Staphylokinase），可导致血浆凝集物解集，出现假阴性[6，7]。 在保证血浆凝固酶方法的有效检测的前提下如何降低假阴性对金黄色葡萄球菌鉴别的影响具有重要临床价值。本课题组根据现有经验，摸索出一套采用动态比浊鉴别金黄色葡萄球菌的方法，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 金黄色葡萄球菌标准菌株（ATCC2592 3），表皮葡萄球菌标准菌（ATCC26069），实验室自留，购于中国菌种保存中心。临床分离菌株经VITEK-2-compact鉴定，所有菌株的鉴定率（identi-fication rate）≥98%，包括金黄色葡萄球菌64株，非金黄色葡萄球菌114株。所有金黄色葡萄球菌经PCR扩增特异性耐热核酸酶（nuc）基因进行再确定。

1.1.2 培养基 营养肉汤培养基及5%羊血琼脂培养基均由实验室自配，人EDTA抗凝混合血浆来源于本院常规体检健康患者，所有操作符合全国临床检验操作规程[8]。

1.1.3 主要试剂及仪器 VITEK-2-compact及其配套试剂购于法国梅里埃公司；Biotek比浊仪购于美国BIO-READ公司；恒温培养箱、超净工作台为国产产品。

1.2 方法

1.2.1 确定动态比浊法检测的最佳波长

1.2.1.1 菌液的制备 首先将金黄色葡萄球菌标准菌ATCC25923从-80℃低温冰箱取出，常温复苏1小时后接种于肉汤，摇匀后用接种环挑取1环接种于血平板上，37℃培养16~18h，操作前取血平板上2~3个菌落接种到肉汤中37℃培养2~3h，随后3000r/min离心3min，倒弃肉汤，用无菌生理盐水调整菌液沉淀使浓度为1个麦氏单位。阴性对照采用表皮葡萄球菌标准株ATCC26069。

1.2.1.2 操作步骤 向96孔板中的每孔加入血浆90 μl及菌液 10μl， 将反应混合液放置于 340nm、405nm、450nm、540nm、590nm 和 630nm 波长下检测吸光度值的变化，反应温度为37℃，设定检测时限6h，每2min检测一次。如果吸光度值增大0.05，则认为反应体系的吸光度值有变化 （仪器本身设定），并认为菌株产生了血浆凝固酶。

1.2.2 动态比浊法检测金黄色葡萄球菌的特异性为了观察该方法鉴别金黄色葡萄球菌是否具有特异性，我们对临床分离的64株金黄色葡萄球菌、114株革兰染色阳性非金黄色葡萄球菌的球菌进行鉴别。具体方法如下：加入10μl浓度为1麦氏单位菌液到 90μl混合人血浆中，340nm、37℃反应，每隔2min判读吸光度值，共计6h。

1.2.3 动态比浊法检测金黄色葡萄球菌的敏感性为了观察动态比浊鉴别金黄色葡萄球菌的敏感性，我们比较分析试管法和动态比浊法对88株金黄色葡萄球菌的鉴别时限。具体方法：动态比浊法为加入10μl浓度为1麦氏单位的金黄色葡萄球菌菌液到90μl混合人血浆中，340nm、37℃反应，设定每隔2min判读吸光度值，共计6h。试管法则是向小试管内加入50μl浓度为1麦氏单位的金黄色葡萄球菌菌液，同时加入450μl混合人血浆，37℃反应，每隔30min判读是否出现凝集，共计6h。

1.2.4 动态比浊法对临床分离金黄色葡萄球菌的快速鉴定 参照VITEK-2-compact对菌株的鉴定，这些菌株包括葡萄球菌、肠球菌等革兰染色阳性的球菌共计189株，标本的分离、培养及鉴定符合临床检验操作规程[8]。具体方法：加入10μl浓度为1麦氏单位的菌液到90μl混合人血浆中，340nm、37℃反应，设定每隔2min判读吸光度值，共计6h。

1.3 数据分析 以VITEK-2-compact检测结果作为参考方法，χ2检验分析2h或6h动态比浊和试管法检测血浆凝固酶的差别；u检验分析动态比浊与试管法检测血浆凝固酶的敏感性差异。

2 结果

2.1 方法的可行性 为了了解动态比浊法检测金黄色葡萄球菌是否可区别于其它细菌，我们采用金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌标准菌株进行检测分析，结果如图1所示：金黄色葡萄球菌标准株（ATCC25923）的吸光度值随反应时间延长而上升（OD≥0.05），而表皮葡萄球菌标准株（ATCC26069）的吸光度值一直处于水平状态。

图1凝固酶阳性葡萄球菌和凝固酶阴性葡萄球菌反应曲线

2.2 反应最佳波长 参照仪器本已固定设定的340nm、405nm、450nm、490、540nm 和 630nm 波 段进行检测，6h内每隔10~20min对吸光度值进行测定，相同时间内，340nm处的OD值升高最快，且一直维持在高水平，故认为变化最为敏感，从而我们认为340nm处检测效果最好。见图2。

2.3 动态比浊法的特异性和敏感性 采用试管法血浆凝固酶作对照，分析动态比浊法的敏感性和特异性。结果表明2h内64株金黄色葡萄球菌中共计58株（90.9%）被鉴定，而试管法仅鉴别38株（59.4%），χ2检验无差别（χ2=3.42，P=0.064），但阳性出现的时间差异明显 （u=3.26，P＜0.001）；6h 内动态比浊法鉴别63株（98.4%），而试管法仅鉴别54株（84.4%），χ2检验值没有差别（χ2=0.46，P=0.50），但鉴别结果阳性出现时间明显早于试管法 （u=2.39，P＜0.01）（表 1）。

图2不同时间、不同波长下动态比浊体系OD值变化曲线

表1 动态比浊与试管法诊断金黄色葡萄球菌相关参数

2.4 临床菌株鉴定 采用动态比浊法随机对临床分离的189株革兰染色阳性球菌鉴别是否为金黄色葡萄球菌，发现所有的88株金黄色葡萄球菌被鉴别出（鉴别准确性100%）；而101株非金黄色葡萄球菌仅1株鉴定为阳性，后经VITEK-2-compact确定为中间葡萄球菌，故认为动态比浊法鉴别金黄色葡萄球菌结果可靠。

3 讨论

金黄色葡萄球菌是临床常见的致病性革兰阳性菌，常导致中毒及社区、医院感染，对金黄色葡萄球菌的快速准确诊断是治疗的前提条件。目前虽然商品化试剂获得广泛使用，但成本较高，基础实验室较难开展。血浆凝固酶试验方法简单，几乎每个实验室都可开展，联合菌落形态，溶血情况等可准确地对金黄色葡萄球菌进行快速鉴别[8]。然而，由于试管法检测血浆凝固酶的敏感度低，故短时间内不能有效地对金黄色葡萄球菌进行鉴别，如表1所示，2h内其鉴别率仅为0.594。反应时间过长则产生的葡激酶对纤维蛋白复合物水解而导致假阴性。本研究根据血浆凝固酶可水解纤维蛋白原为纤维蛋白，导致血浆吸光度值升高，设计了动态比浊法检测血浆凝固酶，反应曲线见图1。通过对不同波长检测获得结果的分析，发现最佳检测波长为340nm（图2），这与文献报道有些差异[9]，考虑到作者加入药物对体系的影响，故认为两者间差异较小。

动态比浊法的主要优势体现在不间断地实时检测反应体系中吸光度值的变化，这种变化肉眼不能判断，故速度更快、更准确。因为金黄色葡萄球菌具有较强的致病能力且常导致食品中毒，故更快地获得确切的结果对于有效地控制疾病的进展及其预防和治疗具有重要的价值。

商品化试剂检测金黄色葡萄球菌虽然操作简便，但需时较长且昂贵。试管法血浆凝固酶则需要较多的人力，如果全部鉴别出，往往需要培养过夜。对于病情严重或食物中毒患者而言，及时鉴定的时间往往可决定病情的进展及治疗的预后。本研究在对临床分离的189株革兰阳性球菌采用参考方法进行鉴别检测时，88株金黄色葡萄球菌全部被检测出，而采用6h动态比浊法共计检测到87株菌，鉴定符合率达98.9%（87/88）；相同时间采用的试管法检测率仅为检测到75株，鉴定符合率为85.2%，两者出现鉴别结果的时间点差异明显 （u=2.39，P＜0.01）；如果以2h作为时间点来观察，时间出现的顺序差异则更加明显（u=3.26，P＜0.001）。 如果将试管法进行过夜培养判断，虽然可检测出血浆凝固酶含量低的菌株，但考虑到金黄色葡萄球菌可产生葡激酶对纤维蛋白复合物的水解而导致假阴性，故阳性率与6h判断差异不大[11]。动态比浊法克服了试管法的上述缺陷，表现为检测能力更敏感，且可实时地监测体系OD值变化，故可观察到葡激酶对复合物的水解作用（表现为OD值下降）。相比于试管血浆凝固酶法对金黄色葡萄球菌的鉴定，动态比浊法仅需动态比浊器而几乎不需要配套耗材，故不存在成本增加及工作量增大的问题。考虑到检测时间及敏感性的优势，故我们认为该方法可有效地代替试管法检测血浆凝固酶鉴别金黄色葡萄球菌。

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