血液病毒核酸检测单独阳性标本研究

田耘博，黄霞，秦伟斐，李维，毛伟，廖红文，段恒英，何涛

(重庆市血液中心，重庆 400015)

献血样本的病毒核酸检测 （nucleic acid testing，NAT）可有效地降低输血相关传染病病毒的传播风险，在采供血机构正广泛普及[1]。运用NAT不仅能检测出很多在酶联免疫吸附检测 （enzymelinked immuno sorbent assay，ELISA）窗口期（window period，WP） 的乙型肝炎病毒 （HBV）、 艾滋病毒（HIV）和丙型肝炎病毒（HCV）感染，还能避免因病毒变异，免疫静默性感染等导致的常规ELISA的漏检[2]。对于体现NAT优势的NAT单独阳性献血样本，其真正的阳性率和不同NAT检测系统结果的差异，我们进行了一些研究和探讨。

1 材料与方法

1.1 标本来源 重庆市血液中心2011年3月-12月经体检和血液快检合格的无偿献血者血液标本47004例。分别用含分离胶的 “非可替”抗凝真空NAT专用采血管（含EDTA-K2喷雾干粉）采集6~8 ml全血用于NAT检测；“BD”抗凝真空采血管（含EDTA-K2喷雾干粉）采集4~5ml全血用于ELISA检测。采集后的标本管置于4℃保存，在采集4~6h内1800g离心10min，检测前置于4℃保存。

1.2 主要仪器 RSP150/200型全自动加样仪 （瑞士TECA公司）和FAME 2420/30全自动酶免分析仪（瑞士HAMILTON公司）、Procleix TIGRIS全自动核酸检测分析系统 （美国诺华公司）及配套的PRI(试剂准备温育器，美国Chiron公司)、MAGCOR核酸全自动提取仪（台湾MAGCORE公司）、ABI7500荧光定量PCR仪（美国ABI公司）、RT3100洗板机（深圳雷杜公司）、EXL808酶标仪 （美国BIO-TEK公司）、L535R离心机（湖南湘仪公司）。

1.3 主要试剂 ⑴ELISA检测试剂：HBsAg为乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒 （北京万泰，批号：350277、350279；法国生物梅里埃，批号： BM4732、BM3328）、丙型肝炎病毒抗体诊断试剂盒（上海科华，批号：201105432、201105443；美国强生，批号：GH5809、GH5897）、HIV（1+2）P24 抗原及抗体诊断试剂盒 （法国生物梅里埃，批号：BV32876、HG33287）、HIV抗体诊断试剂盒（上海科华，批号：201101234、201103213）。⑵核酸检测试剂：Procleix Ultro核酸检测试剂盒 （美国诺华公司，批号：613254），该试剂可同时定性检测人类血浆中的HIV-1 RNA、HCV RNA和HBV DNA，试剂盒内含有配套的Procleix HIV-1/HBV/HCV鉴别试剂；血液核酸筛查试剂盒 （上海科华公司，批号：20119325）。⑶乙肝血清学标志物检测试剂和HB-sAg中和确证试剂：乙型肝炎诊断试剂盒（HBsAb、HBeAg、HBeAb 和 HBcAb）（上 海 科 华 ， 批 号 ：201103025、201102016、201105109、20110615）、Hepanostika HBsAg Ultra Confirmatory中和确证试剂盒（法国生物梅里埃，批号：B12NA）。

1.4 检测过程

1.4.1 ELISA 对47004例无偿献血标本的HBsAg、抗-HCV、抗-HIV及HIV P24Ag用2种ELISA试剂在FAME 2420/30上平行检测，相关的操作严格按照试剂盒说明书和仪器说明书进行。当标本OD值/Cut off值（S/CO值）≥0.8判为反应性，标本S/CO值<0.8时，判定为无反应性。2种试剂均为反应性判定为ELISA检测阳性，均为无反应性判定为ELISA阴性；单试剂反应性用同一试剂做双孔复试，双孔复试中有1孔及以上为反应性则判定为ELISA检测阳性，双孔复试均为无反应性判定为ELISA阴性。

1.4.2 NAT所有标本均采用单人份检测。⑴TMA检测：对47007例献血标本进行ELISA的同时，进行 NAT。 用诺华 Procleix Ultro Assay的 HIV-1、HBV和HCV三项联合核酸检测试剂，基于转录介导 的 扩 增 （transcription mediated amplification，TMA）技术在Procleix TIGRIS上进行检测。对联检反应性的标本，再用Procleix HIV-1/HBV/HCV Discriminatory Assay鉴别试剂在同一台仪器上进行鉴别检测，以确定具体的感染病毒类型。⑵交替NAT：对TMA试剂联检阳性而ELISA检测阴性的标本，采用科华血液核酸筛查试剂盒利用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)技术进行交替NAT，MAGCORE全自动核酸提取系统进行核酸提取，用科华的血液核酸筛查试剂在ABI7500荧光定量PCR仪上进行扩增检测，所有操作均按相应的仪器和试剂盒说明书进行。

1.4.3 乙肝两对半检测和HBsAg中和确证检测 对NAT联检阳性的标本用科华乙型肝炎诊断试剂盒，采用手工法在洗板机和酶标仪上进行检测。按相应的仪器和试剂盒说明操作，由酶标仪配套软件判定结果。判定标准：当标本S/CO值≥1判为阳性，标本S/CO值<1时，判定为阴性。选取余量足够，状态较好的部分剩余标本，做HBsAg中和确证检测，按相应的仪器和试剂盒说明书操作，由HBsAg确证试剂说明书的方法计算并判定结果。

1.4.4 数据统计和分析 将NAT、ELISA、乙肝血清学标志物检测和HBsAg中和确证检测的结果数据输入电脑，采用Microsoft Excel 2003软件进行汇总和分类统计，对2种NAT检测方法的结果和乙肝血清学标志物检测的阳性标本数构成比在SAS 8.0软件上采用配对四格表资料的χ2检验进行统计学比较；对所含例数较少的项目间比较，采用Fisher确切概率法检验。

2 结果

2.1 常规NAT总体情况 在47007例献血标本中，检测出ELISA阴性而NAT(TMA)联检阳性的标本108例。通过对这108例标本进行NAT(TMA)鉴别检测，检出HBV DNA阳性40例（鉴别阳性率37.0%），未检出HIV RNA阳性和HCV RNA阳性者。

2.2 联检阳性鉴别阳性标本的分析检测 在鉴别为HBV的40例标本中选出了余量足的13例，进行PCR、HBsAg中和抗体确证实验和乙肝血清学标志物ELISA检测，其结果见表1。PCR能检测出其中的9例含HBV DNA （检测阳性重合率为69.2%），HBsAg结果均为不确定；乙肝血清学标志物中，均没有抗原存在，不同种类抗体阳性组合呈多样性。

2.3 联检阳性鉴别阴性标本的分析检测 对NAT(TMA)联检阳性但鉴别阴性的68例标本，选出余量足的30例，进行PCR、HBsAg中和抗体确证实验和乙肝血清学标志物检测，其结果见表2。在NAT(TMA)联检阳性但鉴别阴性的68例标本中，PCR发现了2例含HBV DNA（检测阴性重合率为93.3%）；HBsAg结果均为不确定；乙肝血清学标志物中，均没有抗原存在，不同种类抗体阳性组合呈多样性。

2.4 2种NAT方法的结果对比 选取的43例NAT（TMA）联检单阳性标本，包括NAT(TMA)鉴别阳性13例、阴性30例，均进行了PCR和乙肝血清学标志物检测，TMA和PCR的检测结果既有相同叠加，也有各自的单独反应性。TMA鉴别检测阳性和阴性标本之间，各项乙肝血清学标志物阳性率各不相同，具体结果见表3。

3 讨论

NAT的优势在于检测出以往仅用ELISA不能发现的病毒感染[1]。在本项研究中共发现了108例ELISA阴性而NAT联检阳性的献血标本，对其进行NAT鉴别检测出37.0%(40/108)为HBV，其余63.0%(68/108)为阴性。本研究中HBV DNA的检出率为0.85‰（40/47004），不仅与上海[3]、南京[4]等地区的报道基本相同，也与印度[5]报道的0.88‰接近。HBV在我国乃至世界范围内依然是一个较大的公共卫生问题[6]，HBsAg检测作为一种常规筛查手段，在采供血机构的应用有力地提高了血液安全性[7]。本研究对43例ELISA阴性而NAT联检阳的标本进行HBsAg中和确证实验，没有发现确证阳性，说明现有的HBsAg检测特异性较好，但HBsAg阴性的血液仍然可能发生HBV的传染[8]。HBsAg阴性血液导致输血传播HBV的残余风险，一般发生在血清学转化前的窗口期或者感染末期[6]。对于HBV，NAT不仅能有效的发现处于HBsAg ELISA的WP献血者[9]，还能检测出隐匿性乙肝感染（occult HBV infection，OBI）献血者[10，11]。

表1 2种NAT结果为HBV的标本乙肝血清学标志物和HBsAg确证结果比较

表2 TMA鉴别阴性标本的PCR结果及乙肝血清学标志物和HBsAg确证结果比较

表3 TMA联检单独阳性标本的鉴别结果和PCR结果及乙肝血清学标志物综合比较

一般将HBV DNA持续存在，而HBsAg为阴性的HBV感染称为OBI[12]，OBI的发病机理尚不明确，但大多认为是感染者和诸多病毒因子的联合作用，将HBV的病毒复制抑制在一个可控的低水平[13]。OBI在HBV感染的整个过程中，HBsAg都呈阴性[14]。OBI中的HBsAb的阳性率约为50.0%[3]，在本研究中TMA鉴别阳性和阴性标本中HBsAb的阳性率都在50.0%左右，之间并无显著性统计学差异（P>0.05）。很多情况下，OBI的唯一血清标志物就是HBcAb[15]，包括鉴别阳性和阴性在内的43个联检单阳性标本，其乙肝血清学标志物中HBcAb阳性比例都最高，分别为84.6%和73.3%且差异无统计学意义（P>0.05）。NAT联检和鉴别均为阳性的13例标本中有85.0%（11例）为HBcAb阳性，因此该类型标本大部分为OBI。

在TMA联检单独阳性的标本中，出现了63.0%（30例）的鉴别检测阴性，其中用PCR发现2例HBV，可认为是真阳性[16]。这种联检和鉴别检测结果不一致的原因，现在还不完全清楚，可能和检测低载量病毒的随机取样差异和鉴别检测的灵敏度有关。当血液中病毒载量处于很低水平时，可能出现DNA和HBsAb等标志物检测的不确定性，也就是这一次能检测到，而下一次可能检测不到[2]，鉴别检测阴性的标本在联检时所呈的反应性未必是假阳性[16]。因此NAT鉴别阴性的这部分标本中，可能有HBV ELISA的WP或OBI。

本研究还发现TMA和PCR这2种病毒核酸检测体系对NAT单阳性的标本检测能力没有显著性的差别（P>0.05），均能较好地胜任日常的检测工作[17]。但究竟用哪一种能更好的检测OBI，现在尚不清楚[18]。但它们有各自单独发现的HBV DNA，这2种NAT方法结果不一致的主要原因可能是OBI者的血液中含低水平的HBV DNA，而NAT检测假阴性的原因就在于病毒在血浆中含量极少，呈泊松分布型的不均匀分布[13]。我国献血者HBV DNA单独阳性中，大多（近80.0%）为OBI，且这些血液中的HBV DNA载量都较低，约在178IU/ml以内，中位数为14IU/ml[19]，而本研究中采用的Procleix Ultro检测HBV DNA灵敏度为30IU/ml[20]，加上病毒颗粒在血浆中呈不均匀分布导致每次检测的取样误差造成了检测结果的不确定[4]。

对HBV血清学标志物5项中不同反应性项目的组合，其不同的结果有不同的解释[21]。可一旦伴随HBV DNA的检出就表示处于病毒携带状态。因此对献血标本进行NAT，可有效地减少窗口期、OBI导致的输血传播HBV[22]。本研究发现NAT联检单独阳性的标本中有37.0%鉴别为HBV，余下的63.0%鉴别阴性中存在少量的假阴性标本[23]。NAT的单阳性标本无论鉴别反应性还是阴性，其乙肝血清学标志物中的HBcAb阳性比例最高，OBI的可能性也就最大，由于OBI的HBV DNA载量低，导致了TMA和PCR方法的NAT结果具有一定的差异。

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