应用双向电泳、免疫印迹和质谱技术筛选乳腺癌相关抗原*

朱丽英， 肖卿玉， 杨 柳， 潘 卫， 李 兴

(贵州医科大学 医学检验学院， 贵州 贵阳 550004)

应用双向电泳、免疫印迹和质谱技术筛选乳腺癌相关抗原*

朱丽英， 肖卿玉， 杨 柳， 潘 卫， 李 兴**

(贵州医科大学 医学检验学院， 贵州 贵阳 550004)

目的： 筛选乳腺癌相关抗原。方法： 提取乳腺癌T-47D细胞株总蛋白，采用双向电泳技术进行分离后转膜，分别采用乳腺癌患者血清和对照血清作为一抗进行Western blot分析，比较杂交蛋白点的差异，取差异蛋白点行液相色谱串联质谱分析并通过数据库查询，鉴定抗原。结果： 筛选出10个差异蛋白，取其中3个仅与乳腺患者血清反应的蛋白行质谱分析显示，这3个蛋白分别为脯氨酰-4-羟化酶β亚基、人类真核翻译延伸因子1γ、磷酸甘油酸变位酶1。结论： 成功鉴定了3个可能的乳腺癌相关抗原。

乳腺肿瘤； 癌； 抗原； 电泳； 免疫印迹法； 质谱分析

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，近年来其发病率逐年上升，且发病人群越来越年轻，因此受到人们的广泛关注。早期诊断是治疗乳腺癌、降低死亡率的关键[1]，传统的乳腺检查方法不能早期诊断乳腺癌，寻找乳腺癌特异性抗原将有助于乳腺癌早期诊断和导向治疗。目前，以蛋白质双向电泳、免疫印迹和质谱技术为代表的蛋白质组学技术已被广泛应用于肿瘤的研究，但其在乳腺癌中的研究报道尚少[2-3]。本研究的目的是通过双向电泳、免疫印迹技术和质谱分析筛选乳腺癌相关抗原。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 标本来源 收集2008年12月～2009年3月收治的20例女性乳腺癌患者(无其它自身免疫性疾病)的静脉血清作为病例组，患者采血前和手术前未进行放疗、化疗和内分泌治疗，年龄34～78岁，平均49.5岁；所有患者组织标本均经病理结果证实。另外同期采集20例体检健康女性静脉血清作为对照组，年龄36～75岁，平均52.8岁。对照组均经系统健康体检，无乳腺相关疾病史、其它自身免疫性疾病和恶性肿瘤家族史。采所有被检者空腹静脉血5 mL，尽快分离血清，-80 ℃保存。人乳腺癌细胞株T-47D细胞购自中国科学院细胞库。

1.1.2 主要试剂 高糖DMEM培养基购于美国Gibco公司，线性固相pH梯度(immobilized pH gradient，IPG)干胶条(pH 3～10，13 cm)、裂解液、胰蛋白酶均购自Amershan biosciences 公司，辣根过氧化物酶标记的兔抗人IgG购自武汉博士德公司，聚偏氟乙烯(PVDF)膜购自美国Millpore公司，ECL化学发光试剂盒购自美国Pierce公司。

1.2 方法

1.2.1 T-47D细胞培养及总蛋白的制备 T-47D细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养液，置于5% CO2细胞培养箱中培养。收集对数生长期的细胞，加入5倍体积裂解液(7 mol/L尿素，2 mol/L硫尿，4% CHAPS，65 mmol/L DTT，0.2% Bio-Lyte)混匀，液氮中反复冻融3～4次(每次置液氮中3 s，室温融化)，加入20 mg/L脱氧核糖核酸酶，离心1 h(4 ℃，20 000×g)，取上清即为细胞总蛋白。用Bradford法检测蛋白浓度，将样品分装并且于-80 ℃保存。

1.2.2 双向电泳 700 μg T-47D细胞总蛋白与水化液(7 mol/L尿素，2 mol/L硫尿，4%CHAPS，65 mol/L DTT，0.2%两性电解质，0.001%溴酚蓝)混匀，上样总体积为250 μL。将IPG胶条(pH 3～10，13 cm)再水化，室温溶胀14 h。将溶胀好的胶条转移至EttanIPGphorⅡ等电聚焦仪进行第一向等电聚焦。胶条经两次平衡后转至12.5% SDS-PAGE凝胶进行第二向电泳，起始电流为5 mA，待溴酚蓝至分离胶后调至25 mA，待溴酚蓝前沿达底部停止电泳。

1.2.3 Western blot分析 T-47D细胞总蛋白经双向电泳分离后，经半干转印法转印至PVDF膜并封闭2 h，分别与1:100稀释的病例组或对照组血清(一抗)于室温孵育2 h，用TBST洗膜液洗膜(10 min×3次)；与辣根过氧化物酶标记的兔抗人二抗(1∶3 000)室温孵育2 ，再经TBST溶液洗膜(10 min×3次)，最后经ECL化学发光检测得到胶片，观察杂交信号点，并确定发生免疫反应的蛋白在双向电泳凝胶上的位置。

1.2.4 图像扫描和质谱分析 完成考马斯亮蓝染色的双向电泳凝胶以及曝光的胶片经Imagescaner进行扫描，且采用图像分析软件Imagemasters6.0对扫描图像进行强度校正、点检测、背景消减和点匹配等。质谱分析：取双向电泳凝胶上候选蛋白质斑点经胰酶酶解[4]，肽段经液相色谱串联质谱(liquid chromatography tandem mass spectrometry, LC-MS/MS)分析，用Mascot搜索引擎搜索NCBInr数据库，获知氨基酸序列。

1.3 统计学分析

采用SPSS 17.0软件对每一个蛋白与病例组血清和对照组血清反应的频率进行统计学分析。两组间率的比较用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 双向电泳凝胶蛋白图谱分析

使用图像分析软件对T-47D细胞总蛋白双向电泳图谱进行分析，在分子量为14.4.0～94 kDa和等电点pI 3.0～10.0的范围内，发现约630个蛋白质点。

2.2 Western blot结果

图1A为T-47D细胞总蛋白与1份对照血清发生免疫反应，发生反应的蛋白较少，大约为4个蛋白点；图1B为T-47D细胞总蛋白与1份乳腺癌患者血清发生免疫反应，发生反应蛋白较多，大约为15个蛋白点，其中有1个蛋白点与患者血清和对照血清都发生反应，只与患者血清发生反应的蛋白点有14个。

2.3 差异蛋白表达

经统计学分析后发现有10个蛋白点与对照组和病例组血清发生反应的频率之间差异具有统计学意义(P<0.05)，见表1、图2。这10个差异蛋白点在双向电泳凝胶上的位置见图3。

注：A、B分别为对照组及病例组血清与T-47D细胞总蛋白发生免疫反应结果，图中蓝点代表该蛋白只与对照血清发生免疫反应，红点代表该蛋白只与患者血清发生免疫反应，绿点代表该蛋白与对照血清和患者血清都发生免疫反应

表1 T-47D细胞总蛋白与正常血清或乳腺癌血清反应频率

图2 10个蛋白点与对照组(N)和病例组(BC)血清发生免疫反应印迹图

图3 10个蛋白点在双向电泳凝胶图上的位置

2.4 差异蛋白质谱鉴定

选取只与病例组血清反应的2号、6号和9号蛋白点经切割、脱色、酶解，再经LC-MS/MS分析显示分别为脯氨酰-4-羟化酶β亚基(prolyl 4-hydroxylase, beta subunit precursor，P4HB)、 人类真核翻译延伸因子1γ(eukaryotic translation elongation factor 1 gamma, EEF1G)及磷酸甘油酸变位酶1(phosphoglycerate mutase，PGAM1)，见表2。

3 讨论

肿瘤相关抗原产生的免疫应答可以发生在肿瘤形成的早期阶段,分离鉴定肿瘤相关抗原有可能发现新的候选肿瘤标志物,这些肿瘤相关抗原可以作为临床免疫治疗的潜在靶标[5]。据此，本研究采用双向电泳技术对乳腺癌细胞株T-47D总蛋白进行分离，分别采用乳腺癌患者血清和对照组血清作为一抗进行Western blot分析，对每一个蛋白与正常血清和患者血清反应的频率进行统计学分析后，发现有10个蛋白与两者发生反应的频率之间差异具有统计学意义(P<0.05)，取其中3个仅与乳腺患者血清反应的蛋白行质谱分析显示,这3个抗原为P4HB、EEF1G及PGAM1。

表2 差异蛋白质谱鉴定结果

P4HB是脯氨酸羟化酶(prolyl hydroxylase, PHD) 的一个 β 亚基。P4HB属于分子伴侣蛋白，是原核和真核生物细胞在应激状态下可被诱导表达的一类具有重要生理功能和高度保守的多肽类蛋白质，其在促进上皮间质转化并促进肿瘤转移方面具有重要作用。研究表明，P4HB浓度升高时，它可以抑制错误折叠蛋白的聚集，浓度降低时，可以促进它的聚集[6]。研究显示P4HB在乳腺癌患者体内表达升高[7]。在本研究中，P4HB与乳腺癌患者血清发生反应，与对照血清不发生反应。乳腺癌患者血清中出现P4HB的自身抗体可能是机体针对该抗原的免疫应答产物，因此血清表达水平增高。

EEF1G属于信号类蛋白，含有N-末端谷胱甘肽S转移酶域，可与氨基酰-tRNA结合，将其运至核糖体，使肽链延长。研究表明，EEF1G在人的结直肠癌患者体内表达升高[8]。目前尚未见EEF1G在乳腺癌中表达情况的报道。本研究结果显示EEF1G只与乳腺癌患者血清发生反应，与对照血清不发生反应。乳腺癌患者血清中出现EEF1G的自身抗体可能是机体针对该抗原的免疫应答产物，EEF1G可能与乳腺癌的发生、发展有关。

PGAM1是一种糖分解酶，主要在糖酵解过程中起作用，因而能促进癌细胞等糖酵解旺盛的细胞生存[9]。研究发现，PGAM1在肺癌、肝癌和食管癌中表达明显升高[10-11]，但在乳腺癌肿瘤抗原方面的研究罕见报道[12]。在本研究中，PGAM1与乳腺癌患者血清发生反应，与对照血清不发生反应。乳腺癌患者血清中出现PGAM1的自身免疫抗体可能是机体针对该抗原的免疫应答产物。PGAM1可能与乳腺癌的发生、发展有关，其具体机制有待进一步研究。

综上所述，乳腺癌患者体内发现的自身免疫抗体所对应的3种蛋白可能与乳腺癌的发生、发展有关，而它们在乳腺癌发病和诊断中的作用还需进一步深入的研究。

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(2015-06-09收稿，2015-07-21修回)

中文编辑： 周 凌； 英文编辑： 赵 毅

Application of Two-Dimensional Electrophoresis, Western Blot and Mass Spectrum to Screen Breast Cancer Associated Antigens

ZHU Liying, XIAO Qingyu, YANG Liu, PAN Wei, LI Xing

(SchoolofMedicalLaboratoryScience,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China)

Objective: To investigate breast cancer associated antigens. Methods: T-47D cell total proteins were extracted and separated by two-dimensional electrophoresis (2-DE), then transferred to PVDF membrane, following by incubation with sera samples from women with and without breast cancer for further Western blot analysis. The proteins hybridized differences were analyzed by liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) and were identified through NCBInr database. Results: Ten different proteins were found, three of which were identified as prolyl 4-hydroxylase, beta subunit precursor, eukaryotic translation elongation factor 1 gamma and phosphoglycerate mutase. Conclusions: Three possible breast cancer antigens have been successfully identified.

breast neoplasms; carcinoma; antigens; electrophoresis; immunoblotting; mass spectrum

贵州省科学技术基金项目(黔科合J字2007-2086)； 贵州省优秀科技教育人才省长专项资金项目(2005-298)； 贵州省省长基金资助项目[黔科教办(2005)14号]

时间：2015-08-07

http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20150807.2232.006.html

R737.9; R34

A

1000-2707(2015)09-0922-04

**通信作者 E-mail:lixing_1211@sina.com