福建东南沿海某战区医院MRSA感染特点及基因多态性分型研究

2015-05-09魏智艺程君涛李小毅刘丁井

解放军医药杂志 2015年3期

魏智艺，程君涛，李小毅，刘丁井

·论著·

魏智艺，程君涛，李小毅，刘丁井

目的了解福建东南沿海某战区医院MRSA感染特点及基因多态性分型情况，为制定院内MRSA感染的防治策略提供分子生物学依据。方法采用头孢西丁试纸片法初步鉴定MRSA菌株，聚合酶链反应(PCR)技术检测MecA基因，最终鉴定临床送检标本所检测出的MRSA菌株，并通过随机引物DNA扩增技术(RAPD)对所检测的MRSA菌株进行基因分型研究。结果经PCR对MecA基因检测，从临床标本及医护人员身上共分离出42株MRSA菌株。采用随机引物DNA扩增技术(RAPD)对细菌进行基因分型，根据同源性分析，42株临床菌株共可以分为12型。其中Ⅰ型共7株，Ⅱ型共2株，Ⅲ型共4株，Ⅳ型共4株，Ⅴ型共7株，Ⅵ、Ⅶ及Ⅷ各1株，Ⅸ型共8株，Ⅹ型共2株，Ⅺ型共3株，Ⅻ型共2株。结论本院MRSA菌株存在相似度大小不同的遗传距离，医院内存在交叉感染可能。

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌;院内感染;PCR;RAPD;聚类分析

近年来，院内感染中多重耐药细菌感染有不断增多趋势，尤其是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)感染，给严重烧伤、创伤及其他危重病患者的治疗带来严峻挑战。虽然目前国内外对MRSA感染已有较多研究，但由于MRSA细菌基因具有多态性，不同地区医院的MRSA基因分型和传播特点也不尽相同。目前对福建东南沿海战区医院内MRSA细菌感染特点及基因多态性分型研究较少，给治疗、预防带来巨大困难，是当前为控制院内感染、提高本战区创伤、烧伤的救治率，降低感染死亡率所迫切需要解决的一道难题。现将某战区医院内MRSA的研究报告如下。

1 材料与方法

1.1 标本采集细菌标本采集自2011—2013年本院临床科室住院患者送检的痰液、创面分泌物、血液、静脉导管尖端，以及陪护人员、医务工作者的双手、鼻腔前庭等部位。

1.2 主要材料头孢西丁纸片及药敏实验所用抗菌药物：青霉素、苯唑西林、氨苄西林、莫西沙星、左氧氟沙星、头孢唑林、哌拉西林/他唑巴坦、红霉素、四环素、利福平、庆大霉素、复方新诺明、克林霉素(均为上海杰瑞丝生物公司产品)、利奈唑胺、替考拉宁、万古霉素(大连医诺生物有限公司产品)。Biospin细菌基因组DNA提取试剂盒(含蛋白酶K)(上海泛科实业有限公司产品)，Premix溶液(包含Ex Taq、dNTP Mixture Ex等)、DNA Marker(大连TaKaRa公司产品)，溶菌酶(上海泛科实业有限公司产品)，琼脂糖(南京森贝伽生物公司产品)，TAE缓冲液(上海迪申生物公司产品)，核酸染料(溴乙啶)(上海振宇化工科技公司产品)，无水乙醇。

1.3 主要仪器细菌接种环、无菌接种台、酒精灯、CO2细菌孵育箱(德国Heraeus)、VIKET-2细菌鉴定仪(梅里埃)，显微镜(OLYMPUS BX53)、移液管、电子比浊仪(HNTD5-TDR-1002)、漩涡混匀器(XK80-A型)、低温冰箱(panasonic)。PCR扩增仪(德国Eppendorf公司)、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、高速离心机、分光光度计、各种量程的微量移液枪。

1.4 引物设计根据文献[1]设计MecA引物，P1:5′-AAAATCGATGGTAAAGGTTGGC-3′，P2:5′-AGTTCTGCAGTACCGGATTTGC-3′。根据文献[2]设计RAPD引物，EricⅡ：5′-AAGTAAGTGACTGGGGGTGAGCG-3′。以上引物均由福州贝克曼生物有限公司合成。

1.5 实验方法及操作流程收集临床送检标本，并进行细菌分离、培养。同时收集医护人员的定植细菌。使用VIKET-2细菌鉴定仪鉴定被测细菌，并进行药敏实验，了解细菌对16种抗生素的耐药情况。药敏实验采用微量肉汤稀释法。

1.5.1 细菌DNA的提取：严格按照Biospin细菌基因组DNA提取试剂盒的说明书进行。

1.5.2 头孢西丁试纸片法鉴定MRSA菌株：根据临床实验室标准化协会(CLSI)制定的标准判断结果[3]，凡头孢西丁抑菌环直径≤19 mm的即表示金黄色葡萄球菌对头孢西丁耐药，可初步判定为MRSA菌株。细菌鉴定和药敏实验使用VIKET-2细菌鉴定仪。

1.5.3 MecA基因PCR扩增体系及条件：反应体系为20 μl，其中DNA模板2 μl，PCR master 10 μl，引物各1.0 μl，最后用灭菌双蒸水补足20 μl。反应参数：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸60 s，共35个循环；最后72℃延伸5 min，反应结束。取扩增产物5 μl在电压120 V，1.5%琼脂糖凝胶电泳40 min，以DNA标志物(DNA Marker)作为参照，凝胶成像系统照相,使用凝胶成像仪观察结果并保存。

1.5.4 RAPD-PCR基因扩增：对MecA基因PCR扩增均阳性的MRSA菌株基因进行扩增并进行分型。RAPD反应体系为20 μl反应体系，其中待测DNA模板2 μl，PCR master 10 μl，Mg2+浓度2.0 mmol/L，引物各1.5 μl，最后用灭菌双蒸水补足20 μl。扩增条件：94℃预变性5 min；94℃变性60 s，25℃退火60 s，72℃延伸120 s，共40个循环；最后72℃延伸5 min，反应结束。取扩增产物5 μl在电压120 V，1.5%琼脂糖凝胶电泳40 min，以DNA标志物(DNA Marker)作为参照，凝胶成像系统照相,使用凝胶成像仪观察结果并保存。

2 结果

2.1 本院院内感染情况本院检验科及感染控制科协助调查并统计院内感染情况，结果显示，2011—2013年期间院内感染率为6.4%，其中呼吸道感染占50.3%(以下呼吸道感染为多见)，创面感染占13.1%，其他感染部位还包括手术切口、胃肠道、泌尿生殖道等。院内感染仍以革兰氏阴性杆菌为主，占64.5%，而革兰阳性球菌占33.7%，存在小部分真菌感染，其中革兰氏阳性球菌较前有上升的趋势。在革兰氏阳性球菌感染中，最主要的是金黄色葡萄球菌感染，且绝大部分金黄色葡萄球菌对抗菌药呈不同程度的耐药。本实验所检测出的MRSA占所有金黄色葡萄球菌的38.9%。

2.2 MecA基因检测结果通过PCR对使用头孢西丁试纸片初步筛查所得的MRSA菌株进行MecA基因检测。其中42株具有MecA电泳条带(533 bp)，被确定为MRSA，其余菌株由于无MecA电泳条带而被排除，见图1、2。

2.3 本院各临床科室MRSA菌株检出分布情况本院各临床科室共检出MRSA菌株42株，其中神经外科检出MRSA菌株12株(28.57%)；烧伤整形科检出10株(23.81%)，呼吸内科检出6株(14.29%)，重症医学病房检出5株(11.91%)，胸外科、骨科分别检出2株(4.76%)，心内科、肿瘤内科分别检出1株(2.38%)，陪护及医务人员检出3株(7.14%)。42株MRSA菌株标本来自痰液18株(42.86%)，创面分泌物10株(23.81%)，血液6株(14.29%)，导管尖端5株(11.90%)，陪护人员鼻腔2株(4.76%)，医务人员手部1株(2.38%)。

2.4 MRSA菌株的药敏实验结果所有检测到的42株MRSA菌株对利奈唑胺、替考拉宁以及万古霉素均敏感；对青霉素、苯唑西林、氨苄西林、头孢唑林、哌拉西林/他唑巴坦均耐药；而对复方新诺明、红霉素、四环素、庆大霉素、克林霉素、左氧氟沙星、莫西沙星、利福平的耐药率分别为：92.9%、92.9%、88.1%、88.1%、85.7%、76.2%、64.3%、61.9%，见表1。

2.5 RAPD基因多态性分型经PCR检测MecA基因鉴定后得到的42株MRSA菌株，经RAPD随机扩增DNA片段，每株菌株均扩增出3～7条不等的电泳条带，见图3。使用Cross Checker V2.91和NTSYSpc V2.10e图像分析、遗传图谱聚类分析软件，对RAPD随机扩增出的细菌DNA条带进行聚类分析。根据条带数目的不同，42株菌株可分为Ⅰ～Ⅻ共12型，其中Ⅰ型共7株，Ⅱ型共2株，Ⅲ型共4株，Ⅳ型共4株，Ⅴ型共7株，Ⅵ、Ⅶ及Ⅷ各1株，Ⅸ型共8株，Ⅹ型共2株，Ⅺ型共3株，Ⅻ型共2株，见图4。

表1 42株MRSA菌株对16种常用抗菌药的药敏实验结果

图1 部分标本DNA抽提后行聚合酶链反应 MecA基因检测结果

无电泳条带标本为MecA阴性，M为DNA Marker

图2 42株临床MRSA菌株MecA阳性基因电泳图谱

M为DNA-Marker

图3 42株MRSA DNA抽提后行RAPD 基因扩增聚合酶链反应电泳图谱

M为DNA Marker，1-42为菌株编号

图4 42株MRSA RAPD基因分型情况

各科室送检MRSA菌株基因型的分布情况，其中神经外科主要以Ⅰ型及Ⅸ型为主，7株Ⅰ型，3株Ⅸ型；而烧伤整形科则以V型多见，共6株，同时检测出3株Ⅲ型细菌；ICU病区分离出的MRSA菌株的型别则分离出4株Ⅳ型菌株；呼吸内科送检5株MRSA菌株，包括4株Ⅸ型以及1株Ⅵ型。从神经外科患者家属的鼻腔分离到的2株MRSA菌株，通过RAPD随机扩增其DNA的多态性，经聚类分析，最后鉴定这2株菌株均为Ⅰ型；而ICU护士的手分离到的MRSA则为Ⅳ型，见图5。

图5 42株MRSA的基因图谱遗传距离树状图

Coffcient为相关系数，S1-S42为菌株编号，Ⅰ～Ⅻ为基因分型

3 讨论

大量研究资料表明MRSA在世界范围内感染率呈逐年上升趋势，是目前公认的院内感染的高危病原菌之一[4]。文献报道，我国每年院内感染中MRSA感染占5%～10%。本次实验共收集MRSA菌株42株，占我院院内感染的7.4%。从送检标本上看，大部分以痰液及创面分泌物为主，与国内各地区及医院的报道相一致[5]。MRSA菌株主要通过空气传播，MRSA菌株容易在呼吸道定植，特别是下呼吸道。此外，我们也发现，创面分泌物中MRSA的检出率也较高，这些标本大部分来源于烧伤科，特别是大面积深度烧伤的危重患者，住院时间较长，长期、大量应用抗菌药物进行抗感染治疗。皮肤作为人体天然的保护屏障，皮肤烧伤、受损后极容易引起细菌的定植与感染[6]。对于烧伤患者应加强创面处理及保护，预防创面脓毒症的出现。同时应提高对创面分泌物细菌培养的送检率，对定植细菌进行动态观察，做到早期预防、早期干预，可有效预防创面MRSA感染。

MRSA之所以对抗生素具有高度免疫性，是由于其耐药机制的复杂多样化决定的，其中通过MecA基因介导编码产生PBP2a，是其最主要也是最重要的耐药机制[7]。MecA基因编码产生青霉素结合蛋白-PBP2a与β-内酰胺类抗生素的亲和力低，从而导致抗菌药物对细菌抑制能力大大下降，出现耐药。据文献报道，使用头孢西丁纸片检测、鉴定MRSA存在一定的误差。MecA基因作为MRSA特有的耐药基因，通过PCR技术检测金黄色葡萄球菌的MecA基因已作为鉴定MRSA的金标准[8]。本次实验首先使用头孢西丁纸片进行筛查，最终通过PCR检测菌株的MecA基因来鉴定MRSA菌株。实验过程中我们发现单独使用头孢西丁纸片鉴定MRSA菌株，存在假阳性率。并且使用头孢西丁纸片筛查MRSA菌株具有操作繁琐、耗时长、消耗了大量的人力成本等问题。如进行大样本的检测，建议首选使用PCR技术直接检测其MecA基因，特别是医院内发生可疑的MRSA暴发流行时，可以为制定防治策略节省宝贵的时间。为了解细菌的耐药机制，目前对院内病原菌进行分型更多的是通过细菌自身基因进行分型，随着分子生物学的发展，目前基因分型的方法较多。20世纪90年代初人们开始利用RAPD技术来检测DNA的多态性，其原理就是使用随机引物，通过PCR技术对所研究的DNA进行随机扩增，通过对所得到的不同电泳条带进行分析，进而研究其是否存在同源性[9]。本实验利用RAPD技术对筛查出的MRSA菌株进行检测，分析其是否存在同源性。从电泳指纹图谱的结果上看，大多数菌株的DNA可扩增出4～7个条带。应用生物医学软件，对DNA扩增所得的条带进行系统的同源聚类分析，42株临床菌株共归类为12个基因型，其中Ⅰ型、Ⅴ型及Ⅸ为我院主要的优势菌株。本次实验未发现我院某种细菌型在院内广泛传播，这与有关院内MRSA感染的流行菌株型较单一的报道存在一定的差异，这可能与本次实验样本量较小有关。同时本次实验也发现各个科室的流行菌株较为集中。如神经外科以Ⅰ型为主，烧伤整形科以V型多见，而ICU病区分离出的MRSA菌株大部分为Ⅳ型。呼吸内科主要为Ⅸ型。某种程度上验证了相关机构的研究结果。有研究显示，患者感染的MRSA与其病房环境中分离出的MRSA菌株具有高度同源性[10]。本实验发现，神经外科、烧伤整形科、呼吸内科、ICU等科室MRSA的检出率较高，同时分别从神经外科患者家属的鼻前庭以及ICU护士的手部分离出MRSA菌株，从基因型上看，其与该科室流行菌株具有高度的同源性。这进一步说明了医院内病区之间、科室之间、患者之间以及医护人员与患者之间可能存在相互传播及交叉感染。

MRSA菌株在人体最常见的定植部位是皮肤和鼻前庭部，临床上可使用鼻拭子定期采集检测患者鼻腔定植菌的情况，特别是长时间住院患者。一旦发现携带MRSA菌株，应增强标本的送检次数，密切观察病情变化，尽可能做到单间隔离或者同种病原菌入住同一病房，以防交叉感染[11-13]。

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A Study on Characteristics and Genetic Polymorphisms of MRSA Infection in a PLA Hospital in Southeast Coastal Region of Fujian Province

WEI Zhi-yi, CHENG Jun-tao, LI Xiao-yi, LIU Ding-jing

(Department of Burns and Plastic Surgery, 180 Hospital of the PLA, Quanzhou, Fujian 362000, China)

Objective To study the characteristics and genetic polymorphisms of methicillin resistant staphylococcus aureus (MRSA) infection in a PLA hospital in southeast coastal region of Fujian Province, and to provide the molecular biological basis for prevention and control strategies of nosocomial MRSA infection. Methods MRSA strains were initially detected using Cefoxitin indicator paper, and MecA genes were detected using polymerase chain reaction (PCR) technology, MRSA strains detected from clinical samples were identified, and then genotyping of detected MRSA strains were studied using synthetic primer and random amplification of polymorphic DNA technique(RAPD). Results The MecA genes after PCR detection showed that 42 strains of MRSA strains were isolated from clinical specimens and the medical staff. The MRSA genotypes were differentiated with RAPD technology, and homologous analysis categorized 42 clinical MRSA strains into 12 genotypes, in which 7 strains of Type I, 2 of Type II, 4 of Type III, 4 of Type IV, 7 of Type V, 1 of Type VI, 1 of Type VII, 1 of Type VIII, 8 of Type IX, 2 of Type X, 3 of Type XI and 2 of Type XII. Conclusion MRSA strains have genetic distances of different sizes of similarity in our hospital, therefore nosocomial cross infection is possible.

Methicillin-resistant staphylococcus aureus; Nosocomial infection; Polymerase chain reaction; Random amplification of polymorphic DNA technique; Cluster analysis