脉冲电磁场与正弦交变电磁场对成骨细胞增殖与成熟矿化的比较研究

闫娟丽，陈克明，周 建，方清清，马慧萍



·论著·

脉冲电磁场与正弦交变电磁场对成骨细胞增殖与成熟矿化的比较研究

闫娟丽，陈克明，周 建，方清清，马慧萍

目的 探讨0.6 mT 50 Hz脉冲电磁场和1.8 mT 50 Hz正弦交变电磁场对大鼠颅骨成骨细胞增殖与成熟矿化的影响。方法 采用酶消化法分离大鼠乳鼠颅骨成骨细胞，接种培养于10% 胎牛血清(FBS)的α-MEM 培养基中，成骨细胞融合到80%～90%，传代培养，随机分成3组，分别为对照组、脉冲电磁场组和正弦交变电磁场组，分别测定细胞增殖、碱性磷酸酶(ALP)活性，并进行碱性磷酸酶染色和茜素红钙化结节染色。结果 脉冲电磁场组OD值明显高于正弦交变电磁场组和对照组(P<0.01)，正弦交变电磁场组明显低于对照组(P<0.01)；第6天脉冲电磁场组ALP活性明显高于正弦交变电磁场组和对照组(P<0.01),第9天脉冲电磁场组和正弦交变电磁场组ALP活性均明显高于对照组(P<0.01)。脉冲电磁场组和正弦交变电磁场组ALP染色、茜素红面积和克隆数均显著高于对照组(P<0.01)。结论 脉冲电磁场和正弦交变电磁场都能最终促进成骨细胞的成熟矿化，使其形成新骨，但其作用机理不同。

脉冲电磁场；正弦交变电磁场；成骨细胞；骨质疏松

骨质疏松症(osteoporosis, OP)是一种骨量减少、骨组织显微结构受损、继而引起骨骼脆性增加和骨折危险度升高的一种全身骨代谢障碍疾病[1]，被称为无声无息、静悄悄发生的流行病，临床以腰背疼痛、身长缩短、驼背,甚至骨折为主要表现[2]。越来越多的证据显示[2-3]，生物物理干预可提供一种安全有效地抑制骨质疏松的方法，使骨量增加而不破坏骨的重建过程。电磁场可以改变人体电磁场环境，促进成骨细胞的增生，抑制骨吸收的活力，使骨密度增加，并能改善骨疼痛，故有利于骨质疏松的治疗[4-6]。本实验组已研究出不同强度脉冲电磁场(pulse electromagnetic fields， PEMFs)和正弦交变电磁场(sinusoidal electromagngetic fields， SEMFs)对成骨细胞增殖和成熟矿化的强度筛选[7-8]，分别筛选出0.6 mT、50 Hz脉冲电磁场和1.8 mT、50 Hz正弦交变电磁场为促进成骨细胞成熟矿化的最佳强度，交变电磁场是交变电流提供电源产生的磁场，脉冲电磁场是由脉冲电源提供产生的电磁场[9]，其磁场波形不同，其最佳强度也不同，本实验通过比较脉冲电磁场和正弦交变电磁场对成骨细胞的增殖及成熟矿化的影响，找到最佳波形电磁场治疗骨质疏松症，从而为研究电磁场骨质疏松治疗仪提供理论数据。

1 材料与方法

1.1 电磁场发生装置 超低频电磁场细胞处理仪由本实验室自行研制(专利号：ZL 201120528654.3)，主要由控制软件及电脑、信号采集卡、磁场电源和磁场线圈等组成。培养细胞置于磁场线圈内，线圈长27 cm，内径10 cm，多组线圈经过特殊设计和绕制后可在内部产生一个12 cm×9 cm×9 cm的均匀磁场区，磁场均匀度小于1/1000，可确保在此范围内的所有细胞均受到相同磁场的处理。磁感应线圈经紫外线照射消毒放入细胞培养箱内，通过导线与外部控制装置相连。实验期间培养箱内温度控制在(37±0.2)℃。

1.2 实验动物 出生48 h以内的8只SPF级SD大鼠乳鼠[甘肃省中医学院动物实验中心提供，许可证号：SCXK(甘)2004-0006-152]。

1.3 试剂与仪器 α-MEM培养基(Gibco公司)；胎牛血清(兰州民海生物公司)；β-甘油磷酸钠、地塞米松、磷酸化的维生素C、胰蛋白酶、Ⅱ型胶原酶、二甲基亚砜(DMSO)、甲基噻唑基四唑(MTT)、茜素红均来自于Sigma公司；碱性磷酸酶试剂测定盒(南京建成生物工程研究所)；青霉素、链霉素购自华北制药;电磁场处理仪；倒置相差显微镜(Olympus， Japan)、细胞培养箱(Thermo Revco， USA);全波长酶标仪。

1.4 实验方法

1.4.1 大鼠颅骨成骨细胞的培养：8只大鼠乳鼠脱颈处死后，用75%乙醇浸泡10 min，剥取颅骨，剪碎至1 mm3左右，无菌磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗两次，用0.25%胰蛋白酶[含1 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)]37℃水浴消化10 min，消化2次，弃掉上清，用0.1%Ⅱ型胶原酶(含1 mmol/L EDTA)37℃水浴消化10 min，弃掉上清，剩余的骨碎片用0.1%Ⅱ型胶原酶37℃水浴消化20 min，消化3次，收集消化液，每次消化完的消化液用含10%胎牛血清的α-MEM 培养基终止消化，收集消化液，用200目的细胞筛过滤后，1000 r/min离心10 min，收集细胞，将细胞密度调整至2×105cell/mL接种于100 mm培养皿中，24 h后用PBS漂洗2次，换含新鲜培养基，待细胞生长融合到80%，进行传代培养。

1.4.2 分组及细胞增殖分析：原代培养成骨细胞生长融合到80%，用0.25%胰蛋白酶消化悬浮后，以细胞密度1×104cell/ml传代接种于35 mm中皿(P1)，随机分为脉冲电磁场组、正弦交变电磁场组和对照组，每组3个平行做3份，次日细胞贴壁生长后开始磁场处理，强度分别为脉冲电磁场0.6 mT(脉冲电磁场组)、正弦交变电磁场1.8 mT(正弦交变电磁场组)，1.5 h/d，对照组每天同样在磁场线圈中放置1.5 h，但不通电，故磁场强度为0 mT。线圈放置在37℃、5%的CO2培养箱中，磁场处理3 d后，弃去培养液，加入2 ml 0.5%MTT，在37℃孵育4 h，弃MTT,加入2 ml DMSO，轻微震荡10 min,在520 nm处测吸光度(OD)。

1.4.3 成骨性分化分析：成骨细胞以1×105cell/ml的密度接种于35 mm中皿，待融合到80%，加成骨性诱导剂(1×10-8mol/L地塞米松,10 mmol/L β-甘油磷酸纳，1×10-4mol/L磷酸化的维生素C)，次日开始电磁场处理。

1.4.4 碱性磷酸酶(ALP)活性的测定：磁场处理6、9、12 d测ALP活性，测定方法按试剂盒说明书进行，弃培养基，用PBS洗两遍，加入基质液和缓冲液250 μl，轻微震荡混匀，37℃孵育15 min,加入显色液750 μl,在520 nm处测OD。

1.4.5 ALP染色：电磁场处理9 d，进行ALP染色，用PBS漂洗2次，10%甲醛固定30 s，PBS漂洗2次，加入ALP染色液(pH=9.2的Michaelis氏巴比妥-HCl缓冲液20 ml中含α-萘基磷酸钠和固蓝B盐各20 mg)。当出现紫褐色斑点时即弃染色液，PBS漂洗，观察，照相。

1.4.6 钙化结节染色：电磁场处理12 d，进行钙化结节染色，PBS洗两遍，3.7%甲醛固定10 min，PBS漂洗两遍；加入0.1%茜素红Tris-HCL染色液(pH=8.3)，37℃水浴60 min，PBS漂洗，干燥后计数，照相。

2 结果

2.1 成骨细胞形态学观察 原代成骨细胞培养4 h后开始贴壁，初期呈三角形、纺锤形或椭圆形，贴壁24 h后成骨细胞开始增殖，72 h后细胞开始融合为单层；磁场处理4～5 d后成骨细胞变得更加饱满，磁场处理9 d ALP染色，磁场处理10～12 d可见明显成熟的矿化结节，磁场处理12 d，茜素红染色显示钙化结节，见图1。

图1 倒置相差显微镜下成骨细胞形态观察(×40)

A.原代培养4 h，细胞呈三角形、纺锤形和椭圆形；B.磁场处理4 d成骨细胞变得更加饱满;C.磁场处理9 d ALP 染色;D.磁场处理12 d形成成熟矿化结节;E.磁场处理12 d茜素红染色显示钙化结节

2.2 MTT增殖结果 脉冲电磁场组、正弦交变电磁场组和对照组OD值分别为4.043±0.062、2.100±0.071、3.142±0.050，脉冲电磁场组OD值明显高于对照组(P<0.01)，正弦交变电磁场组明显低于对照组(P<0.01)。脉冲电磁场组与正弦交变电磁场组比较差异具有统计学意义(P<0.01)。

2.3 ALP活性测定 第6天脉冲电磁场组ALP活性明显高于对照组和正弦交变电磁场组(P<0.01),正弦交变电磁场组与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)；第9天脉冲电磁场组和正弦交变电磁场组ALP活性均明显高于对照组(P<0.01)，脉冲电磁场组与正弦交变电磁场组比较差异无统计学意义(P>0.05)；第12天3组ALP活性比较，差异无统计学意义(P>0.05),见表1。

表1 3组成骨细胞碱性磷酸酶活性比较

注：与对照组比较，bP<0.01;与正弦交变电磁场组比较，dP<0.01

2.4 ALP染色结果 脉冲电磁场组、正弦交变电磁场组和对照组ALP染色克隆面积分别为(0.544±0.114)、(0.599±0.126)、(0.127±0.027)cm2，ALP染色克隆数分别为5342.753±1227.433、5320.330±267.524、1728.526±787.369。脉冲电磁场组和正弦交变电磁场组ALP染色克隆面积和克隆数均明显高于对照组(P<0.01)，脉冲电磁场组与正弦交变电磁场组两组间比较差异无统计学意义(P>0.05)，见图2。

2.5 茜素红染色结果 脉冲电磁场组、正弦交变电磁场组和对照组ALP茜素红染色面积分别为(0.066±0.011)、(0.042±0.005)、(0.004±0.002)cm2，茜素红染色克隆数分别为1933.332±83.978、1651.671±176.684、84.667±21.939。脉冲电磁场组与正弦交变电磁场组茜素红染色面积和克隆数均显著高于对照组(P<0.01)，脉冲电磁场组与正弦交变电磁场组之间比较差异无统计学意义(P>0.05)，见图3。

A B C

A.脉冲电磁场组；B.正弦交变电磁场组；C.对照组

图2 第9天3组成骨细胞碱性磷酸酶组织化学染色

A B C

A.脉冲电磁场组；B.正弦交变电磁场组；C.对照组

图3 第12天3组成骨细胞钙化结节染色

3 讨论

随着人口寿命及老年人口不断增加，作为中老年退行性重要疾病之一的骨质疏松症及其所引起的骨折已成为一个严重的社会问题，从而备受老年病学者的关注。WHO已把骨质疏松症列为仅次于心血管病的第二大公众健康问题[10]。骨质疏松症的防治一般可分为药物治疗和物理治疗,药物治疗在临床上使用广泛,临床上通常给予钙剂类或雌激素药物治疗[11],但由于老年人对钙的摄入、吸收和利用能力下降，其不良反应多，费用高，患者依从性差，使其应用受到了很大的限制，所以探索新的治疗途径十分必要。

越来越多的证据显示[2-3]，生物物理干预可能提供一种安全有效地抑制并在一定年龄段内逆转骨质疏松的方法，使骨量增加而不破坏骨的重建过程。低频电磁场在骨形成、骨重建中的作用已经被近年来的大量研究所证明[12-19]，对这一现象的解释目前多基于著名的压电效应以及机械应力是刺激成骨第一信号的生物物理学理论。随时间变化的电场产生磁场,随时间变化的磁场产生电场,相互依存的电场和磁场总称为电磁场。当电磁场作用在生物体系上时,生物体系中的各种物质将以感应的方式对交变的电场和磁场做出应答与反应,从而产生电磁场的生物学效应。研究显示电磁场能克服传统治疗方法的缺陷，对骨质疏松引起的疼痛、骨量减少、骨密度降低具有一定的治疗作用，并且已经部分应用于骨质疏松症的康复治疗中。电磁场改变人体电磁场环境，促进成骨细胞的增生，抑制骨吸收的活力，使骨密度增加，并能减轻骨疼痛，故有利于骨质疏松的治疗。普遍认为电磁场的作用存在“窗效应”现象,即只有在一定相对狭窄的强度(或频率)范围内,电磁场才具有生物学效应。本实验室也证明了“窗效应”现象，本实验室已研究出的两种不同波形的电磁场(脉冲电磁场和正弦交变电磁场)，通过不同磁场强度对成骨细胞增殖与成熟矿化的影响，筛选出最佳强度0.6 mT、50 Hz脉冲电磁场和1.8 mT、50 Hz正弦交变电磁场以促进成骨细胞的增殖、成熟矿化。但没有系统性的比较哪一个是最佳的电磁场，本实验就此问题对成骨细胞的细胞形态、增殖、ALP活性、ALP组织化学染色、钙结节染色进行了系统的对比研究。从细胞形态来看，0.6 mT、50 Hz脉冲电磁场和1.8 mT、50 Hz 正弦交变电磁场没有引起细胞形态的变化，即从细胞形态来看，脉冲电磁场和正弦交变电磁场没有改变细胞的形态.

MTT增殖实验显示，脉冲电磁场促进了成骨细胞的增殖，而正弦交变电磁场抑制了成骨细胞的增殖，细胞增殖是生物最根本的生命活动,是个体生长和生命延续的基本保证,在正常情况下,细胞遵循着一定的细胞周期,通过自我复制进行增殖,磁场对细胞周期的影响主要表现在对细胞的S、G2期进程起促进或阻断作用,脉冲电磁场与正弦交变电磁场通过不同的方式影响细胞的周期，从而到达抑制或促进细胞增殖的作用。

ALP是成骨性分化的早期标志。ALP活性显示，脉冲电磁场和正弦交变电磁场对ALP活性的影响从第6天到第9天明显上升，第12天又开始下降，第6天，脉冲电磁场组ALP活性明显高于对照组,正弦交变电磁场组与对照组比较无显著差异。第9天，脉冲电磁场组和正弦交变电磁场组ALP活性均明显高于对照组。由此说明脉冲电磁场从一开始就对ALP的活性产生影响，而正弦交变电磁场是从中后期才开始对成骨细胞的ALP活性产生影响。

ALP染色和钙化结节染色说明成骨细胞成熟矿化的情况，这有利于新骨的形成，脉冲电磁场组和正弦交变电磁场组ALP染色、茜素红染色克隆面积和克隆数均显著高于对照组，而两组间比较无统计学意义，说明脉冲电磁场和正弦交变电磁场同样程度的促进钙盐的沉积，有利于新骨的形成。综上所述，脉冲电磁场和正弦交变电磁场都能最终促进成骨细胞的成熟矿化，使其形成新骨，但无论是影响细胞周期还是影响成骨性分化的指标其作用机理不同。

[1] 李险峰.骨质疏松症的临床类型及其特点[J].新医学,2007,38(5):344-347.

[2] 李志锋,程国政,翟远坤,等.脉冲电磁场防治骨质疏松症的研究进展[J].中国骨质疏松杂志,2009,15(2):158-161.

[3] 杨淑蓉,吴靖川,施海虹,等.POP-01脉冲电磁场型骨质疏松治疗系统的应用[J].上海第二医科大学学报,2004,24(6):469-471.

[4] 贾雪,何成奇.脉冲电磁场治疗绝经后骨质疏松症的研究进展[J].华西医学,2009,24(1):247-250.

[5] 朱淑霞,李永华,宋治远,等.电磁场促进骨髓间充质干细胞体外诱导分化时细胞增殖[J].第三军医大学学报，2008,30(5):421-423.

[6] 李丽荣,罗二平,申广浩,等.脉冲电磁场对体外培养成骨细胞的影响[J].中国医学物理学杂志,2005，22(1):388-390.

[7] Zhou J, Ming L G, Ge B F,etal. Effects of 50 Hz sinusoidal electromagnetic fields of different intensities on proliferation, differentiation and mineralization potentials of rat osteoblasts[J].Bone, 2011,49(4):753-761.

[8] 闫娟丽,王鸣刚,陈克明,等.不同强度50Hz脉冲电磁场促进大鼠颅骨成骨细胞矿化成熟最佳参数的筛选[J].中国生物化学与分子生物学报,2014，30(7):721-729.

[9] 周建,陈克明,葛宝丰,等.电磁场的应用与研究进展[J].现代生物医学进展,2011,11(24):5162-5168.

[10]甄仙梅,曹芳.老年骨质疏松症预防与治疗进展[J].中国保健营养,2013,23(1):486-487.

[11]Lewiecki E M. Prevention and treatment of postmenopausal osteoporosis[J].Obstet Gynecol Clin Nor Amer, 2008,35(2):301-315.

[12]关志成,杨小卫,王黎明,等.脉冲电磁场对骨质疏松的生物效应[J].高电压技术,2007,33(2):1-6.

[13]Sun L Y, Hsieh D K, Yu T C. Effect of pulsed electromagnetic field on the proliferation and differentiation potential of human bone marrow mesenchymal stem cells[J].Bioelectromagnetics, 2009,30(4):251-260.

[14]Rosen C J, Compston J E, Lian J B. Primer on the metabolic bone diseases and disorders of mineral metabolism[M].John Wiley & Sons, 2009.

[15]Martino C F, Belchenko D, Ferguson V,etal.The effects of pulsed electromagnetic fields on the cellular activity of SaOS-2 cells[J].Bioelectromagnetics, 2008,29(2):125-132.

[16]朱淑霞,宋治远,罗向东,等.电磁场干预大鼠骨髓间充质干细胞向心肌方向诱导分化的研究[J].武警医学院学报,2009,18(5):377-379,395.

[17]孙振强,纪卫政,李涛,等.供体骨髓间充质干细胞抑制肝移植大鼠免疫排斥的研究[J].中华消化外科杂志,2009,8(6):449-452.

[18]叶青,刘曦明,黄武,等.仿生脉冲电磁场对大鼠骨密度下降预防治疗作用的实验研究[J].华南国防医学杂志,2008,22(2):52-55.

[19]周建,陈克明,葛宝丰.50Hz正弦交变电磁场促进体外培养成骨细胞分化成熟的双“强度窗”效应[J].生物物理学报,2011,27(6):507-516.

Comparative Study of Effects of Pulsed Electromagnetic Fields and Sinusoidal Electromagnetic Fields on Osteoblastic Proliferation and Maturity Mineralization in Rats

YAN Juan-lia, CHEN Ke-minga, ZHOU Jiana, FANG Qing-qinga, MA Hui-pingb

(a. Osteology Institution, b. Pharmacy, Lanzhou General Hospital of Lanzhou Military Area Command, Lanzhou 730050, China)

Objective To investigate effects of 0.6 mT 50 Hz pulsed electromagnetic fields (PEMFs) and 1.8 mT 50 Hz sinusoidal electromagnetic fields (SEMFs) on proliferation and maturity mineralization of skull osteoblasts (OB) in rats. Methods Enzyme digestion was used to obtain bone cells from neonatal SD rats' skulls, and the cells were cultured in α-MEM containing 10% fetal bovine serum (FBS). When the OB values reached 80%-90% confluence, they were given serial subcultivation and were randomly divided into control group, PEMFs group and SEMFs group. The cell proliferations, alkaline phosphatase (ALP) activity, ALP staining and calcified node staining were respectively detected in the three groups. Results The optical density (OD) value in PEMFs group was significantly higher than those in SEMFs and control groups (P<0.01), while the value in SEMFs group was significantly lower than that in control group (P<0.01); ALP activity on 6thd after treatment was significantly increased compared with those in control and SEMFs groups (P<0.01), and ALP activities on 9thd after treatment in PEMFs and SEMFs groups were significantly increased compared with that in control group (P<0.01). The values of ALP staining, Alizarin red area and cloning number in PEMFs and SEMFs groups were significantly higher than those in control group (P<0.01). Conclusion Both PEMFs and SEMFs can eventually promote osteoblasts proliferation and maturity mineralization, and then induce formation of new bones with different mechanisms.

Pulsed electromagnetic fields; Sinusoidal electromagnetic fields; Osteoblasts; Osteoporosis

国家自然科技基金(81270963，81471090);甘肃省科技重大专项资助项目(09ZNKDA025)

730050兰州，兰州军区兰州总医院骨科研究所(闫娟丽、陈克明、周建、方清清)，药材科(马慧萍)

陈克明：E-mail:chenkm@lut.cn

R329.2

A

2095-140X(2015)03-0006-05

10.3969/j.issn.2095-140X.2015.03.002

2014-06-16 修回时间：2014-11-28)