建立人多发性骨髓瘤NOD/SCID小鼠皮下移植瘤动物模型

丁江华，袁利亚，陈国安



多发性骨髓瘤实验专题

·论著·

建立人多发性骨髓瘤NOD/SCID小鼠皮下移植瘤动物模型

丁江华，袁利亚，陈国安

目的 探讨建立人多发性骨髓瘤(MM)NOD/SCID小鼠皮下移植瘤动物模型的方法。方法 在NOD/SCID小鼠皮下接种1×107个人MM细胞株(MM1.S或RPMI-8226)，每3～4 d记录小鼠体重、肿瘤体积及生存期；如肿瘤生长超过规定最大径仍未死亡，即处死小鼠，取其皮下移植瘤进行病理检测与CD138免疫组化染色。结果 总成瘤率为75%(9/12)；荷瘤小鼠皮下移植瘤形成的高峰时间为接种后第15～18天，瘤体体积在接种后第35～40天达高峰，平均体积分别为1710.8 mm3(MM1.S组)与1749.5 mm3(RPMI-8226组)；NOD/SCID小鼠在荷瘤后第13～14天即开始有死亡，生存期最长达38～42 d，两组小鼠的中位生存时间均为荷瘤后28 d；皮下移植瘤病理检测与CD138检测证实瘤组织为浆细胞来源。结论 于NOD/SCID小鼠皮下接种人MM细胞(1×107个)，建立人MM移植瘤动物模型成功率高，且无须射线预处理、技术要求较低、操作过程简单及瘤体观察方便，可作为MM动物实验研究的主要模型之一。

多发性骨髓瘤；NOD/SCID小鼠；模型,动物；肿瘤移植

多发性骨髓瘤(multiple myeloma, MM)属起源于浆细胞的恶性肿瘤，约占血液肿瘤的13%，居血液肿瘤第2位。近10年来，MM治疗尽管取得了长足的进展，但至今为止MM仍属不可治愈性疾病。通过建立动物模型探讨MM的药物治疗与方法，成为MM研究的关键步骤。目前，由于非糖尿病性肥胖/严重联合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠具有T、B、NK细胞缺陷，已广泛用于建立各种实体肿瘤的动物模型，但目前在血液肿瘤中的应用研究尚少。因此，我们通过接种骨髓瘤细胞悬液于NOD/SCID小鼠皮下的方法，建立人MM移植瘤动物模型，成瘤率达75%，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验试剂 RPMI-1640培养基、青链霉素混合液(双抗)、胎牛血清(FBS)等购自美国Gibco公司。CD138抗体为鼠源性抗体，购自长沙艾佳生物技术有限公司。

1.2 实验动物 NOD/SCID小鼠SPF级12只，雄性，鼠龄4周，体重18～22 g，购于北京华阜康生物科技公司[许可证号：SCXK(京)2009-0004]。严格饲养于SPF级动物实验室中，室温保持在22～24℃，湿度保持在50%～55%，光线控制为明暗交替(12 h明与12 h暗)，饲料经60Co照射，垫料与饮用水均经高压灭菌处理。

1.3 细胞培养 MM1.S细胞株由中国医学科学院血液病医院邱录贵教授惠赠；RMPI-8226细胞株由浙江大学附属第二医院血液科赵小英教授惠赠。MM1.S与RPMI-8226细胞常规培养于含10%FBS、青霉素与链霉素组成的完全RPMI-1640培养基中，置于37℃、5%CO2的培养箱中进行培养，每3～4 d传代1次。所有实验均取对数生长期细胞。

1.4 NOD/SCID小鼠皮下移植瘤模型的建立

1.4.1 小鼠备皮准备：根据文献报道[1]，4%硫化钠对实验表皮损伤最小。于接种前2天，选取小鼠左或右前肢背部皮肤，用棉签蘸取4%硫化钠溶液轻轻涂抹皮肤进行备皮。

1.4.2 制备瘤细胞悬液：分别收集MM1.S与RPMI-8226细胞，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次去除胎牛血清，PBS重悬细胞以台盼蓝染色，细胞活力在95%以上，调整细胞浓度为10×107/ml。

1.4.3 瘤细胞皮下接种：根据预实验结果，选择在每点接种肿瘤细胞绝对数1×107个(即100 μl瘤细胞悬液)，注意防止抽针后针孔外溢。根据接种细胞类型分组，分为MM1.S组与RPMI-8226组，每组接种6只小鼠。

1.5 荷瘤小鼠指标的监测

1.5.1 一般情况：观察两组小鼠的精神、活动情况，每3～4 d记录小鼠的体重、肿瘤体积、肿瘤破溃及死亡情况。

1.5.2 肿瘤体积：每3～4 d使用游标卡尺测量肿瘤最大径(a)与最小径(b)，按如下公式计算肿瘤体积：V=1/2×ab2。

1.5.3 生存期：在预实验中发现当移植瘤最大径超过3.5 cm时，荷瘤小鼠即呈现明显消瘦、食差、行动过于迟缓等恶病质，即行颈椎脱臼处死小鼠。因此，生存期从荷瘤小鼠移植瘤形成开始，至小鼠自然死亡或处死为止。

1.6 荷瘤小鼠皮下移植瘤的病理检测 实验小鼠处死后取小鼠的肿瘤组织，分别用于细胞印片行瑞氏染色、石蜡切片行HE染色，以及CD138免疫组化染色为证实为浆细胞来源肿瘤。

1.7 统计学方法 应用SPSS 19.0软件进行统计分析，直接观察指标采用描述性分析，肿瘤体积以均数表示，生存时间以中位数表示。

2 结果

2.1 荷瘤小鼠肿瘤生长情况 在接种后5 d内，所有实验小鼠接种部位可见圆形的小皮丘，直径为3～5 mm，而后于接种后第7～10天内逐渐消失。期间小鼠精神、活动正常，体重仍呈上升趋势。

在接种后第15～18天，9只小鼠(即MM1.S组5只，RPMI-8226组4只)形成肉眼可见的椭圆形或圆形皮下肿块，直径为5～8 mm，成瘤率为75%(9/12)。此时，小鼠渐出现精神变差、活动缓慢、消瘦等情况。随时间延长移植瘤体积逐渐增大，在接种后第35～40天小鼠肿瘤体积达高峰，两组移植瘤平均体积分别为1710.8 mm3(MM1.S组)与1749.5 mm3(RPMI-8226组)，此时小鼠精神变差、明显消瘦、行动过于迟缓，部分移植瘤开始出现破溃坏死，见图1、2。

图1 两组NOD/SCID小鼠皮下移植瘤体积变化

2.2 荷瘤小鼠生存期 对形成移植瘤的小鼠进行生存期分析，发现在接种后第13～14天即开始有小鼠死亡，生存期最长达38～42 d。两组小鼠的中位生存时间均为接种后28 d，见图3。

图2 两组NOD/SCID小鼠皮下移植瘤大体观察A、B为MM1.S组小鼠；C、D为RPMI-8226组小鼠

2.3 荷瘤小鼠移植瘤病理检测 完整取下实验小鼠的移植瘤组织，分别行瑞氏染色与HE染色，镜下发现有成团或成巢分布的瘤细胞，CD138免疫组化染色显示强阳性，见图4、5。

图3 两组荷瘤小鼠生存期分析

图4 荷瘤小鼠移植瘤组织镜下病理形态

A.MM1.S组(瑞氏染色×400);B.MM1.S组(HE×1000);C.RPMI-8226组(瑞氏染色×400);D.RPMI-8226组(HE×1000)

图5 荷瘤小鼠移植瘤组织免疫组化结果

3 讨论

建立动物模型是实验研究最常用的方法。目前，MM动物模型主要包括两种：①皮下移植瘤动物模型；②人胎骨植入移植瘤动物模型。其中，前者由于取材简便、操作简单、观察直观等优点，已成为广泛应用的MM动物模型，而后者主要用于研究MM骨病。目前，在动物方面可选择裸鼠、Babl/c小鼠、SCID小鼠及NOD/SCID小鼠等。多数研究显示，与实体肿瘤移植瘤相比，作为血液肿瘤的MM，移植瘤成瘤率约8%～40%，成为制约MM实验研究的主要因素[2]。因此，提高MM移植瘤成瘤率是迫切需要解决的重要课题。1959年Merwin和Algire[3]首次在Babl/c小鼠中通过腹腔内植入塑胶建立了MM动物模型。尽管这种小鼠模型分泌的单克隆蛋白(仅为IgA)与人MM细胞所分泌的单克隆蛋白(多数为IgG)存在明显差异性，但仍是当时最好的MM动物模型[4]。在1985年发现在衰老的C57BL/KaLwRij品系小鼠中存在自发的MM疾病，被命名为5T骨髓瘤模型[5]。由于该模型仅少数分泌IgG球蛋白，多数分泌IgA，且成瘤率<10%，因此在MM实验研究中的意义有限[6]。随后，有学者建立了Myc/Bcl-Xl双转基因MM小鼠动物模型[7]。可惜的是，在该小鼠模型中romidepsin显示强抗MM作用，但在人MM病例中却未观察到抗癌作用[8]。值得关注的是，这种模型同时合并淋巴瘤的发生率高达30%～40%[9]，与临床MM病例的发病特征不相符，因此逐渐被研究者放弃。SCID小鼠存在T与B淋巴细胞缺陷，先后应用于建立腹腔MM模型、移植瘤MM模型与人胎骨植入MM模型。由于SCID小鼠还具有正常的NK细胞、巨噬细胞(M )与淋巴因子激活细胞(LAK)的功能，一定程度上可降低瘤细胞植入成活率[10]。据文献报道，在SCID小鼠中MM动物模型的成瘤率约30%～40%[11-12]。

NOD/SCID小鼠是在SCID小鼠的基础上与NOD小鼠(NOD/Lt)品系回交的免疫缺陷鼠。NOD/SCID小鼠既有NK细胞与补体C5缺乏，又有T和B淋巴细胞缺乏，且较少发生排斥反应及移植物抗宿主病(GVHD)，所以逐渐成为血液学实验研究的常用动物。王雅丹等[13]通过射线预照射与骨髓瘤细胞悬液(RPMI-8226)接种的方法，在5只NOD/SCID小鼠中成功建立了MM荷瘤小鼠模型。然而，NOD/SCID小鼠对放射高度敏感，4 Gy射线照射后即可导致造血系统衰竭而死亡，而且可能导致MM细胞弥漫性浸润(如胃肠道)，一定程度上增加了荷瘤NOD/SCID小鼠的自然死亡率，对于实验研究特别是观察药物疗效有时反而不利[14-16]。

因此，我们尝试单用瘤细胞接种的方法，对NOD/SCID小鼠进行MM1.S与RPMI-8226两种骨髓瘤细胞皮下接种，结果发现移植瘤成功率达75%(9/12)。此外，对于NOD/SCID小鼠长出的移植瘤进行病理与CD138染色，结果表明采用单独瘤细胞接种方法，在NOD/SCID小鼠中完全可以建立MM移植瘤动物模型，且成瘤率非常高。在本实验中，我们选择了两种具有K-Ras突变的MM细胞株，即地塞米松敏感株(MM1.S)与地塞米松耐药株(RPMI-8226)，均成功地建立了移植瘤模型。徐冰等[17]在NOD/SCID小鼠中建立了肝癌移植瘤动物模型，成瘤率为100%。研究表明：NOD/SCID小鼠对不同瘤细胞类型均具有极高的成瘤率。相比SCID小鼠而言，NOD/SCID小鼠成瘤率显著升高。分析原因可能与NOD/SCID小鼠极少发生免疫渗漏(<10%)，而SCID小鼠免疫渗漏发生率达90%[18]。

综上所述，本实验单用瘤细胞接种方法，在NOD/SCID小鼠中成功地建立了MM移植瘤动物模型，且皮下移植瘤经病理与CD138染色证实为MM细胞。不过，本实验也存在不足：皮下移植瘤的MM模型并不能完全模拟MM的病理生理发生过程。但是，关于在免疫正常/缺陷小鼠中人MM细胞特异性归巢并在骨髓中增殖的移植瘤模型，至今报道较少[19]。本实验所采用的方法无须射线预处理，具有技术要求较低、操作过程简单、瘤体观察方便等优点，可作为MM动物实验研究的主要模型之一。

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Establishment of Subcutaneous Xenograft Models of Human Multiple Myeloma in NOD/SCID Mice

DING Jiang-hua1, YUAN Li-ya2, CHEN Guo-an3

(1. Department of Hematology and Oncology, 171 Hospital of the PLA, Jiujiang, Jiangxi 332000, China; 2. Hematology Institution, Academy of Medical Science of Jiangxi Province, Nanchang 330006, China; 3. Department of Hematology, the First Affiliated Hospital of Nanchang University, Nanchang 330006, China)

Objective To investigate the establishment method of subcutaneous xenograft models of human multiple myeloma (MM) in nonobese diabetic/serious combined immunodeficiency disease (NOD/SCID) mice. Methods A total of 1×107cell lines (MM1.S or RPMI-8226) were subcutaneously injected into NOD/SCID mice, and the body weight, tumor volume and survival time were recorded every 3-4 d. The mice would be sacrificed if the ones with the biggest tumor diameter were still alive, and the xenografts were taken off to observe pathology and CD138 immune-histochemical staining. Results The total rate of tumor formation was 75% (9/12). The peak time of xenograft formation was found in 15th-18thd after injection in NOD/SICD mice. The maximum of tumor volume occurred in the 35th-40thd after injection, and the mean volume of xenografts for MM1.S and RPMI-8226 cells were 1710.8 mm3and 1749.5 mm3respectively. The initial death occurred in the 13th-14thd, and the longest survival time was 38th-42thd after NOD/SCID mice began to carry xenografts. The median overall survival time was 28 d in the two groups. The pathology and CD138 immune-histochemical staining showed that the tissues came from plasma cells. Conclusion The subcutaneous xenograft models can be established using the method of injecting myeloma cells (1×107) into NOD/SCID mice without irradiation pretreatment with a high successful rate, which may be used as one of the main animal models for MM study.

Multiple myeloma; Nonobese diabetic/serious combined immunodeficiency disease mice; Models, animal; Neoplasm transplantation

国际合作专项基金(2011DFA32820)；国家自然科学基金(81460037)

332000 江西 九江，解放军171医院血液肿瘤科(丁江华)；330006 南昌，江西省医学科学研究院血液研究所(袁利亚)；330006 南昌，南昌大学第一附属医院血液科(陈国安)

陈国安，E-mail:gachen923@hotmail.com

R-332

A

2095-140X(2015)03-0041-04

10.3969/j.issn.2095-140X.2015.03.010

2014-11-12 修回时间：2015-01-09)