逍遥篓贝散联合顺铂对乳腺癌细胞裸鼠荷瘤能力的抑制作用研究

齐泽华，韩 涛，刘军灵，郭 放，马东初，韩雅玲，刘兆喆，谢晓冬



中医药研究

·论著·

逍遥篓贝散联合顺铂对乳腺癌细胞裸鼠荷瘤能力的抑制作用研究

齐泽华，韩 涛*，刘军灵，郭 放，马东初，韩雅玲，刘兆喆，谢晓冬

目的 比较逍遥篓贝散联合顺铂与单药顺铂对乳腺癌细胞成瘤能力的影响及并分析逍遥篓贝散是否能减少顺铂的不良反应，期望为临床应用中药逍遥篓贝散联合顺铂治疗乳腺癌提供基础实验依据。方法 建立乳腺癌细胞系MCF-7荷瘤小鼠模型，将12只裸鼠随机分成3组，每组4只。以肿瘤生长情况和抑瘤率为指标，观察各组药物对荷瘤小鼠肿瘤生长的抑制作用；以小鼠的一般情况、血清肌酐、尿素氮为指标，观察联合用药是否能减少顺铂治疗的不良反应。结果 逍遥篓贝散联合顺铂组与单药顺铂组对乳腺癌细胞系MCF-7成瘤能力均有不同程度的抑制作用，逍遥篓贝散联合顺铂组和单药顺铂组肿瘤体积较对照组显著减少(P<0.01)，逍遥篓贝散联合顺铂组荷瘤小鼠一般情况好于单药顺铂组，并且肌酐、尿素氮水平低于单药顺铂组(P<0.05)。结论 逍遥篓贝散具有抗肿瘤作用，与顺铂联合使用，在增加抑瘤作用的同时，可一定程度减少顺铂的不良反应。

逍遥篓贝散；顺铂；乳腺肿瘤；大鼠,裸

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一，占女性全部恶性肿瘤的22%，是危害女性健康的重要疾病[1]。乳腺癌曾在中国等发展中国家低发，然而随着社会经济环境等诸多因素的发展，乳腺癌的发病率在世界范围内迅速增加，仅仅10年时间乳腺癌的总体发病率提高了10倍[2]，在中国乳腺癌更以每年2.7%的比例快速增长[3]。目前乳腺癌的治疗仍然以手术切除为主，并且术后辅助化疗及内分泌治疗也成为乳腺癌的重要治疗方法，但作为我国千年传承的中医中药在乳腺癌治疗中的作用往往为人们所忽视，越来越多的证据提示，中医药治疗可以显著改善乳腺癌的治疗效果，极大改善乳腺癌患者的进展及预后，为乳腺癌患者的治疗提供了新的选择[4-5]。

顺铂是较常用的一种化疗药物，具有抗癌谱广、作用强、与多种抗肿瘤药有协同作用且无交叉耐药等特点，为当前联合化疗中常用的药物之一，常用于晚期乳腺癌的治疗[6]，但是乳腺癌对顺铂为主的化疗具有相对不敏感性，且治疗后易复发转移，导致预后不良[6]。逍遥篓贝散具有疏肝健脾，行气散结的双重功效。现代药理研究证实，中药逍遥篓贝散中的特定组分能促进淋巴母细胞转化，抑制肿瘤生长，对细胞免疫和体液免疫均有一定促进作用[7]，且与某些化疗药联合应用，在疗效上显现协同作用，并能减轻化疗药的不良反应，有重要的抗肿瘤活性[8-9]。目前，逍遥篓贝散联合顺铂对乳腺癌细胞在裸鼠体内成瘤能力的抑制作用报道较少，本研究拟比较逍遥篓贝散联合顺铂与单药应用顺铂对乳腺癌细胞成瘤能力的抑制作用，并分析逍遥篓贝散是否能减少顺铂的毒副作用，期望为临床应用中药逍遥篓贝散联合顺铂治疗乳腺癌提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与药物 清洁级裸鼠12只，体重20～30 g，6周龄，购于上海中科院实验动物中心。乳腺癌细胞株(MCF-7)为本实验室自备。逍遥篓贝散散剂(购自沈阳中医院药局)，组分：柴胡、当归、白芍、茯苓、贝母、法半夏、制南星各10 g,生牡蛎30 g,白术12 g,瓜蒌、山慈菇各15 g；注射用顺铂冻干型(齐鲁制药有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 乳腺癌细胞MCF-7培养：含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基培养，种植于10 cm培养皿中，待细胞生长至80%左右时，0.5%胰蛋白酶消化，用生理盐水重悬后800 rpm离心除去胰酶，用台盼蓝进行细胞计数。取对数生长期MCF-7细胞2×105个，用100 μl生理盐水混匀于Ep管中，吹打至单细胞悬液，备裸鼠荷瘤用。

1.2.2 MCF-7荷瘤小鼠模型的制备：将小鼠逐只称重记录并随机分为逍遥篓贝散联合顺铂组、顺铂单药组、对照组3组，每组各4只。无菌条件下，在每只小鼠右后肢皮下注射已经准备好的乳腺癌单细胞悬液2×105个，制作裸鼠皮下荷瘤模型。

1.2.3 给药：接种第3天开始给药。对照组给予生理盐水100 μl/次瘤周注射，隔日1次；顺铂组给予顺铂2 mg/(kg·次)瘤周注射，隔日1次；顺铂联合逍遥篓贝散组除给予顺铂2 mg/(kg·次)隔日瘤周注射外，同时给予逍遥篓贝散按50 mg/(kg·次)剂量灌胃，隔日1次；共给药21 d后停药，继续观察至第8周。期间常规饲养，每日观察荷瘤小鼠活动能力、进食及瘤体变化情况。

1.2.4 肿瘤体积测量：每周测量肿瘤直径(d)，至第8周对荷瘤小鼠行脱臼处死，计算小鼠荷瘤体积(V=1/2d3)。抑瘤率=对照组肿瘤体积-用药组肿瘤体积/对照组肿瘤体积。

1.2.5 肌酐、尿素氮水平测定：处死荷瘤小鼠时摘取眼球采血，室温静置2 h左右后，3000 r/min，5min离心取上层血清。送检验科分别测定尿素氮、肌酐水平。

2 结果

2.1 荷瘤小鼠肿瘤体积和抑瘤率 逍遥篓贝散联合顺铂组、顺铂单药组和对照组荷瘤小鼠肿瘤体积分别为(0.249±0.157)、(0.469±0.142)、(1.266±0.361)cm3，逍遥篓贝散联合顺铂组及顺铂单药组肿瘤体积均较对照组明显减少(P<0.01)，逍遥篓贝散联合顺铂组肿瘤体积较顺铂单药组减少(P<0.05)；逍遥篓贝散联合顺铂组、顺铂单药组抑瘤率分别为(59.84±17.59)%和(76.89±17.51)%，两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2 荷瘤小鼠一般情况、肌酐、尿素氮水平 实验过程中观察荷瘤小鼠，对照组无裸鼠死亡，但随着瘤体增大活动量逐渐减少且消瘦，毛色晦暗干枯。顺铂单药组裸鼠用药开始时活动明显减少，消瘦较为明显，毛色干枯，但瘤体增长较慢，至第3周时死亡1只裸鼠，治疗后期(第6周～第8周)剩余3只裸鼠状态有所好转，活动量增加，瘤体增长较慢。逍遥篓贝散联合顺铂组小鼠一般情况好于上述两组，无裸鼠死亡，活动能力较上述两组改善，略有消瘦，瘤体增长缓慢。

逍遥篓贝散联合顺铂组、顺铂单药组和对照组荷瘤小鼠肌酐水平分别为(60.448±2.752)、(72.303±3.475)、(25.986±0.789)mmol/L，尿素氮分别为(9.862±0.634)、(13.66±2.333)、(6.438±0.171)mmol/L，逍遥篓贝散联合顺铂组和单药顺铂组的肌酐、尿素氮水平均高于对照组，但逍遥篓贝散联合顺铂组肌酐、尿素氮水平低于单药顺铂组(P<0.05)。

3 讨论

乳腺癌的发生发展是多因素参与并相互作用的结果，涉及环境、饮食、生育和激素失衡等诸多原因，而相关资料显示，遗传易感性和机体内环境的失调及紊乱在乳腺癌的发生发展过程中起到了重要作用[10-14]。传统的乳腺癌治疗手段以手术切除为主，术后的辅助化疗及内分泌治疗也成为乳腺癌的重要治疗方法，这些方法使早期乳腺癌的治疗取得了较好的疗效，但对于晚期乳腺癌的疗效并不理想，近些年来随着抗癌药物的不断研发，晚期乳腺癌患者多采用多药联合、不同途径给药等化学治疗方法，以期患者生存期有所延长，但同时，多药联合化疗严重不良反应也在一定程度上影响着患者的生活质量，因此找到一种既可以调控机体整体免疫状态，改善机体内环境紊乱，又可以协同化疗药物抑瘤作用，减轻化疗药物不良反应的辅助药物成为研究人员所亟须解决的难题。随着循证医学的发展，作为我国千年传承的中医中药在乳腺癌治疗中逐渐进入人们的视野，越来越多的证据表明，强调整体辨证论治的中医药疗法可以显著改善乳腺癌的治疗效果，极大改善乳腺癌患者的不良反应，提高乳腺癌患者的生活质量，为乳腺癌患者治疗方式提供了新的选择[15]。

中医对乳腺癌病机的认识多归结于肝气郁结，脾失健运，乳房为阳明经所司，乳头为厥阴经肝所属，若平素性情不畅肝失调达，郁久则气血瘀滞，纠结日久，积聚于乳房可发为乳腺癌[16]，这与现代医学所认为的乳腺癌是一种全身性疾病不谋而合。而中医药治疗乳腺癌又有着悠久历史，其所强调的“整体观念，辨证论治”的疏肝解郁法始终贯穿于乳腺癌整个治疗进程中[17]。中药逍遥篓贝散最早见于《太平惠民和剂局方》，主治肝郁痰凝之乳癖、乳岩、瘰疬等证。具有疏肝健脾，行气散结的双重功效，其方中主要成分为柴胡、当归、白芍、白术、茯苓，甘草[18-19]。据文献报道[17]，柴胡、当归、白芍疏肝解郁，养血柔肝；白术、茯苓、甘草补脾益肾，燥湿和中。现代药理研究亦证实，白芍能促进淋巴母细胞转化，抑制肿瘤生长，对细胞免疫及体液免疫均有一定促进作用，白术降低癌细胞的增值率，减低瘤组织的侵袭性，提高机体抗肿瘤反应能力及对抗瘤细胞的细胞毒性作用。当归多糖与某些化疗药联合应用，在疗效上显现协同作用，并能减轻化疗药的副作用，有重要的抗肿瘤活性。茯苓多糖激活局部补体使肿瘤临近区域被激活的补体通过影响巨噬细胞，淋巴细胞或其他细胞及体液因子，从而协同杀伤肿瘤细胞，为1种可增强人体免疫功能的多糖物质[20]。柴胡多糖能提高小鼠体液和细胞免疫功能，并使免疫抑制状态有一定程度的恢复，有帮助肿瘤患者恢复食欲的功效。诸药合用，具有疏肝健脾，行气散结功效。然而作为中华瑰宝的中药逍遥篓贝散在现代肿瘤治疗中却往往为人所忽视，本研究聚焦于中药逍遥篓贝散联合顺铂对乳腺癌荷瘤小鼠的体内抑瘤效果研究，具有一定的创新性和临床转化研究价值。

本实验以荷瘤裸鼠为动物模型，首先观察了顺铂单药、逍遥篓贝散联合顺铂对乳腺癌细胞系MCF-7成瘤能力的影响，实验结果显示，逍遥篓贝散联合顺铂组及顺铂单药组肿瘤体积均较对照组明显减少，表明逍遥篓贝散联合顺铂组和顺铂单药组成瘤能力明显低于对照组。逍遥篓贝散联合顺铂组肿瘤体积低于顺铂单药组，逍遥篓贝散联合顺铂组和顺铂单药组的抑瘤率均>30%，说明两组均具有一定抗肿瘤作用，且逍遥篓贝散联合顺铂组应用效果要好于单用顺铂组。其次，实验中可以观察到，顺铂组荷瘤裸鼠给药过程中逐渐出现活动能力降低等与顺铂治疗的不良反应有关的表现，而逍遥篓贝散联合顺铂组裸鼠一般情况要好于顺铂单药组，检测逍遥篓贝散联合顺铂组肌酐、尿素氮水平均低于顺铂单药组，说明联合用药可适当减少顺铂治疗产生的不良反应。这一定程度上提示逍遥篓贝散联合化疗药物治疗乳腺癌可增加化疗药物的抗肿瘤效应，减轻化疗相关不良反应，提高肿瘤患者生活质量，有一定的临床应用价值。

综上所述，通过本研究，从实验角度证实了作为传统中医中药瑰宝的逍遥篓贝散方剂对化疗药物的增效作用，其主要表现在提高肿瘤的缓解率及改善临床症状，降低化疗药物毒性反应，从而使化疗可按时、按剂量、按阶段进行，达到增加治疗目的，提高生活质量，延长生存期的效果，这也为抗肿瘤新药的开发和临床肿瘤治疗提供了新的思路和相关理论依据，具有积极的意义。

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Inhibition Effect of Xiaoyaoloubei Powder in Combination of Cisplatin on Tumor Formation of Breast Cancer Cells in Nude Mice

QI Ze-hua1,2a, HAN Tao2a, LIU Jun-ling2a, GUO Fang2a, MA Dong-chu2b, HAN Ya-ling2c, LIU Zhao-zhe2a, XIE Xiao-dong2a

(1. Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Shenyang 110000, China; a. Department of Oncology, b. Department of Medical Experiments, c. Department of Cardiology, 2. General Hospital of Shenyang Military Area Command, Shenyang 110840, China)

Objective To compare the effect between Xiaoyaoloubei powder in combination of Cisplatin and single Cisplatin on anti-cancer therapy, and to analyze whether Xiaoyaoloubei powder can reduce the adverse effects of Cisplatin or not so as to provide basic experiment support for Xiaoyaoloubei powder in combination of Cisplatin in clinical treatment of breast cancer. Methods Tumor-bearing nude mice models of breast cancer cell line MCF-7 were established, and the 12 nude mice were randomly divided into control group (n=4), Cisplatin group (n=4) and Xiaoyaoloubei powder in combination of Cisplatin group (n=4). The inhibition effects on tumor formation were observed in all groups according to tumor growth and the inhibitory rate as anti-cancer evaluation criterion; the question of whether combined administration could reduce the adverse effects of Cisplatin treatment was also observed according to the general situation of mice, serum creatinine and urea nitrogen as evaluation criterion. Results Both Xiaoyaoloubei powder in combination of Cisplatin and single Cisplatin have inhibitory effects on tumor formation of breast cancer cell line MCF-7 in different degrees, and the tumor sizes in Xiaoyaoloubei powder in combination of Cisplatin and Cisplatin groups were significantly reduced compared with that in control group (P<0.01); the general status in Xiaoyaoloubei powder in combination of Cisplatin group was better than that in Cisplatin group, and the levels of creatinine and urea nitrogen in combined group were decreased compared with those in Cisplatin group (P<0.05). Conclusion Xiaoyaoloubei powder has anti-cancer effect, and in combination of Cisplatin can reduce the adverse reactions of Cisplatin to a certain extent as well as increase the ability of anti-cancer effect.

Xiaoyaoloubei powder; Cisplatin; Breast Neoplasms; Rats, nude

科技部十二五重大新药创制平台(2012ZX09303016-002)；2012年辽宁省科技攻关计划(2012225019)

110000 沈阳,辽宁中医药大学(齐泽华)；110840 沈阳，沈阳军区总医院肿瘤科(齐泽华、韩涛、刘军灵、郭放、刘兆喆、谢晓冬)，医学实验科(马东初)，心内科(韩雅玲)

谢晓冬,E-mail：doctor_xxd@163.com；刘兆喆，E-mail：lzz_summer@126.com

R-332

A

2095-140X(2015)03-0090-04

10.3969/j.issn.2095-140X.2015.03.022

2014-11-17 修回时间：2015-01-20)

*为共同第一作者