电磁场不同处理时间对人脐带间充质干细胞增殖与分化的影响

周 建，马小妮，陈克明，闫娟丽，高玉海，石文贵，方清清，谢艳芳



·论著·

电磁场不同处理时间对人脐带间充质干细胞增殖与分化的影响

周 建，马小妮，陈克明，闫娟丽，高玉海，石文贵，方清清，谢艳芳

目的 研究频率50 Hz强度1.8 mT下的不同处理时间正弦交变电磁场对体外培养人脐带间充质干细胞增殖与分化的影响。方法 体外分离培养人脐带间充质干细胞，传代后随机分为6组，每天于倒置相差显微镜下观察细胞形态；MTT测定细胞增殖；10 d、12 d、14 d和16 d测定ALP活性；15 d行茜素红钙化结节染色以及17 d行vonkossa 染色；第13 d ALP组织化学染色；在磁场处理后的4 d 和 6 d行Real-time RT-PCR检测Ⅰ型胶原(Collagen-Ⅰ)和 骨形态发生蛋白(BMP-2) mRNA表达量的变化。结果 0.5 h组可促进细胞增殖；磁场处理10 d～12 d后细胞出现钙化趋势；2.5 h组在SEMFs处理16 d和18 d后ALP活性均高于对照组(P<0.05)；1.5 h组、2.0 h组和2.5 h组钙化结节茜素红染色面积均高于对照组(P<0.01，P<0.05)；1.5 h组Collagen-Ⅰ mRNA表达水平高于对照组(P<0.05)，2.0 h和2.5 h组ALP组织化学染色面积、Collagen-Ⅰ、BMP-2 mRNA表达水平均高于对照组(P<0.05，P<0.01)。结论 50 Hz 1.8 mT的正弦交变磁场能促进体外培养人脐带间充质干细胞成骨性分化，尤以处理2.5 h促进人脐带间充质干细胞成骨性分化最为明显。

间质干细胞；脐带；电磁场；细胞分化

随着组织工程医学和再生医学工程发展，一些学者发现电磁场(electromagnetic field， EMFs)能促进大鼠骨髓间充质干细胞和成骨细胞成骨性成熟分化[1]。有研究报道50 Hz、1.8 mT的正弦交变电磁场(sinusoidal electromagnetic fields, SEMFs)为促进成骨细胞成熟分化的一个效应窗口[2-3]。人脐带间充质干细胞是一种来源方便的潜在多能分化干细胞，但是电磁场能否促进人脐带干细胞成骨性分化尚未可知，本实验旨在研究人脐带间充质干细胞在电磁场作用下是否具有成骨性分化的能力。实验研究了50 Hz、1.8 mT不同处理时间的SEMFs对体外人脐带间充质干细胞增殖与成骨性分化的影响，实验发现SEMFs能促进人脐带间充质干细胞成骨性分化以及成熟与矿化，因此实验结果有望为人脐带间充质干细胞在组织工程医学和再生医学研究及应用中提供一种新的定向分化手段和方向，同时也为骨髓间充质干细胞提供一种新的替代细胞。

1 材料和方法

1.1 实验试剂 胎牛血清(FBS，兰州民海生物工程公司)，DMEM/F12培养基、胰蛋白酶(购于美国Gibco公司)，地塞米松、磷酸化抗坏血酸、β-磷酸甘油钠、青霉素、链霉素、胰蛋白酶(购于美国Sigma公司)，茜素红(购于上海生物工程有限公司)，碱性磷酸酶试剂盒(购于南京建成生物工程有限公司)及酶标仪(Bio Rad，Model 550)。

1.2 磁场发生仪 实验所用磁场发生仪由本实验组与兰州理工大学和中国科学院近代物理研究所共同设计和研制完成，此磁场发生装置具有磁场参数精准大范围可调，使得实验结果具有可重复性[2]。

1.3 细胞分离和培养 取正常足月产健康婴儿脐带组织(依据医院的相关规定并经过家属知情同意后取材)，浸泡于DMEM/F12培养基中迅速带回实验室。超净台内取出脐带，无菌磷酸盐缓冲液(PBS)或生理盐水漂洗残留血液，去除脐静脉、脐动脉及脐带外膜，剥离Wharton胶，并将其剪碎至1 mm3大小，移至0.1%的Ⅱ型胶原酶中，37℃水浴消化，直至Wharton胶全部消化。收集消化液加入培养液终止消化，收集细胞悬液过200目的细胞筛过滤，1000 r/min离心10 min，弃上清液，用含10% FBS的DMEM/F12培养基重悬浮细胞，在37℃、5%CO2培养箱内培养。细胞贴壁后，第3天首次半量换液，以后每3 d换液1次。每天倒置相差显微镜下观察细胞形态。细胞达70%～80%融合后，用0.1%的胰酶消化传代，继续扩增培养。

1.4 细胞分组与磁场处理 将第一代传代后的细胞(P1)调整浓度4200 cell/cm2[4]接种于60 mm的一次性培养皿中培养12 h后，随机分为6组，置于频率50 Hz，0 mT磁场强度下的为对照组，另外5组分别置于频率50 Hz，1.8 mT磁场强度下，根据每天置于磁场下的时间不同分为0.5 h组、1.0 h组、1.5 h组、2.0 h组和2.5 h组。

1.5 增殖分析 P1细胞接种12 h后采用如上所述的磁场对人脐带干细胞进行处理。磁场处理72 h(第一次磁场处理为0 h开始计算时间)[4]后用含0.5%甲基噻唑基四唑(MTT)的无血清培养基继续培养4 h，弃培养液，加入2.0 ml的二甲基亚砜(DMSO)摇床震荡10 min，待紫色结晶沉淀彻底溶解后于570 nm波长测定吸光度(OD)。

1.6 成骨性分析 将P1代细胞接种于60 mm培养皿，每3 d换液1次，每天使用倒置显微镜观察细胞形态，待细胞70%～80%融合成片时加入成骨性诱导剂进行成骨诱导培养(50 mg/L磷酸化抗坏血酸、10 mmol/L β-甘油磷酸钠和1×10-8mol/L的地塞米松)，在加入成骨性诱导剂后立即按照上述描述的分组和方法对培养细胞进行磁场处理。

1.6.1 碱性磷酸酶(ALP)活性测定：在磁场处理后的12 、14 、16 和18 d分别测定各组细胞的ALP活性，ALP活性测定的方法按试剂盒说明书操作，每组分别按缓冲液∶基质液=1∶1加入充分摇匀；然后37℃水浴15 min，加入3倍于基质液显色液，充分混匀显色后，测定507 nm处OD值，换算成金氏单位。

1.6.2 钙化结节染色：磁场处理至15 d，弃细胞培养液，无菌PBS漂洗2遍，加入10%福尔马林固定10 min，弃固定液后流水冲洗，加入pH=8.9、0.1%的茜素红染色缓冲液，37℃水浴1 h并轻轻摇动，红色斑点出现后，流水冲洗去掉浮色，换固定液照相记录染色结果。照相后采用Ipp (Image-Pro Plus 6.0)灰度分析软件，扫描钙化结节染色区域的面积应用公式：培养皿的面积×(钙化结节染色区域扫描面积/照片中皿的扫描面积)[5]。磁场处理后17 d，弃培养液，无菌PBS漂洗2次，加入10%福尔马林固定10 min，弃固定液，加入新配置5%的硝酸银，紫外灯下照1 h，流水冲洗后，加入硫代硫酸钠还原，棕色斑点出现后换固定液照相记录结果。

1.6.3 ALP组织化学染色：磁场处理至13 d时进行偶氮偶合组织化学染色，取出培养细胞弃培养液，无菌PBS漂洗2次，加10%福尔马林固定30 s，弃固定液，加α-萘基磷酸钠和固蓝的碱性缓冲液，室温静置待紫色斑点出现后停止染色[6]，无菌PBS漂洗去掉浮色观察并记录结果,数据结果分析：照相后采用Ipp(Image-Pro Plus 6.0)灰度分析软件，扫描ALP染色区域的面积应用公式：培养皿的面积×(碱性磷酸酶染色区域扫描面积/照片中皿的扫描面积)，出现紫色斑点后停止染色，观察记录结果。

1.7 基因表达水平分析

1.7.1 Total RNA提取：P1代细胞在第一次磁场处理后第4天和第6天后弃培养液，加入无菌PBS漂洗2次，加入1 mL RNA提取细胞裂解液裂解细胞，向裂解液中加入200 μl三氯甲烷后4℃、12000 r/min离心15 min，小心吸取上清液后加入等体积的异丙醇前后颠倒混匀冰上静置15 min，4℃、12000 r/min离心15 min弃上清液，75%乙醇重悬浮沉淀4℃、12000 r/min离心5 min，弃上清后风干加入无酶水溶解后-70℃保存，琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，调整Total RNA的浓度。

1.7.2 反转录：使用TakaRa Prime ScriptTM reagent Kit(TakaRa Code：DRR037A)反转录试剂盒合成反转录出第一条cDNA链。反应体系：5×Prime ScriptTM Buffer 4 μl，Prime ScriptTM RT Enzyme MixⅠ1.0 μl，Oligo dT Primer (50μmo/L) 1.0 μl，Random 6 Primer(100 μmo/L)1.0 μl，Total RNA 10 μl(1000 ng)补RNase Free水至20 μl、37℃反应15 min，85℃、5 s、-20 ℃保存。

1.7.3 引物设计：根据实验要求，在genbank查询所需要基因目的序列的mRNA序列，后由宝生物(大连)公司根据实验要求设计并合成。Collagen-I: NG_007405，Forward 5′-tgtgcaccaattga aggac-3′ Reverse 5′-cgcatttat tgagtacctg-3产物长度187 bp′; BMP-2：NM_001200.2 Forward 5′-agact gcgcggccggcac-3′，Reverse 5′-agccagccgagccaacactg-3′，产物长度178 bp；GAPDH：NG_007073.2 Forward 5′- ggttctgggctggctaagac -3′，Reverse5′- gcagaaagtacagggagttc -3′，产物长度143 bp。

1.7.4 聚合酶链式反应(PCR)检测：按照Applied Biosystems公司7300仪器操作说明进行实验。其中PCR反应体系20 μl，包括SYBR® Premix Ex TaqTMⅡ(2×)10 μL[2]。PCR反应条件：95℃预变性30 s；94℃变性5 s，退火31 s，40个循环； Real-time RT-PCR数据分析处理采用△△Ct处理数据，采用2-△△Ct表示数据的结果[7]。

2 结果

2.1 人脐带间充质干细胞形态及成骨性分化鉴定 原代人脐带间充质干细胞培养7～9 h后，显微镜下细胞数量开始逐渐增多，细胞形态为长梭形。在原代细胞传一代培养至10 d，细胞汇合达到90%左右，细胞呈极性排列，集落形成。细胞传代后，贴壁速度增快，生长迅速；48 h后，贴壁的细胞间可见有细胞集落形成，细胞大多呈长梭形，细胞核较大，数量也逐渐增多；4 d后首次换液，7～10 d左右细胞便铺满皿底，融合成片，细胞排列较整齐，分布较均匀，生长较一致，杂细胞相对已较少。在成骨性诱导13 d后行ALP组织化学染色鉴定，15 d后行茜素红染色进行成骨性分化鉴定，17 d后行Vonkossa 染色鉴定，见图1。

2.2 细胞增殖分析 0.5 h组、1.0 h组、1.5 h组、2.0 h组、2.5 h组OD值分别为1.744±0.083、1.594±0.058、1.618±0.057、1.577±0.050、1.570±0.083，对照组为1.618±0.058。0.5 h组OD值大于对照组(P<0.05)，其余4组OD值与对照组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。

2.3 ALP活性测定 2.5 h组在SEMFs处理16 d和18 d后ALP活性均高于对照组(P<0.05)，其余4组在SEMFs处理后不同时间段与对照组比较差异均无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 6组人脐带间充质干细胞不同时间段ALP活性测定比较

注：对照组置于频率50 Hz，0 mT磁场强度下；0.5 h组、1.0 h组、1.5 h组、2.0 h组和2.5 h组分别每天置于频率50 Hz，1.8 mT磁场强度下0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h；与对照组比较，aP<0.05

2.4 茜素红钙化结节染色结果 0.5 h组、1.0 h组、1.5 h组、2.0 h组、2.5 h组和对照组茜素红钙化结节染色面积分别为(3.23±0.75)、(3.87±0.86)、(4.56±0.47)、(5.37±0.59)、(5.877±0.61)、(3.12±0.46)cm2。1.5 h组、2.0 h组和2.5 h组染色面积均高于对照组(P<0.01，P<0.05)，其余两组与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)，见图2。

2.5 ALP组织化学染色结果 0.5 h组、1.0 h组、1.5 h组、2.0 h组、2.5 h组和对照组ALP组织化学染色面积分别为(2.2±0.50)、(2.87±0.49)、(2.56±0.73)、(3.37±0.63)、(3.87±0.67)、(2.12±0.44)cm2。其中2.0 h组和2.5 h组ALP组织化学染色面积高于对照组(P<0.05)，其余3组与对照组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。

图1 人脐带间充质干细胞倒置相差显微镜下病理形态(×100)

A.13 d后碱性磷酸酶组织化学染色鉴定；B.成骨性诱导15 d后茜素红染色行成骨性分化鉴定；C.17 d后Vonkossa染色鉴定；D.传代细胞接种48 h后镜下病理形态；E.传代细胞接种4 d后镜下病理形态；F.传代细胞接种9 d后镜下病理形态

图2 正弦交变电磁场处理人脐带间充质干细胞第15天6组茜素红钙化结节染色结果

对照组置于频率50 Hz，0 mT磁场强度下；0.5 h组、1.0 h组、1.5 h组、2.0 h组和2.5 h组分别每天置于频率50 Hz，1.8 mT磁场强度下0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h；A.对照组；B.0.5 h组;C.1.0 h组;D. 1.5 h组;E.2.0 h组；F.2.5 h组

2.6 Ⅰ型胶原(Collagen-Ⅰ)Real-time RT-PCR检测结果 在SEMFs处理人脐带间充质干细胞4 d后，0.5 h组、1.0 h组、1.5 h组、2.0 h组、2.5 h组和对照组人脐带间充质干细胞Collagen-Ⅰ mRNA表达水平分别为1.01±0.23、1.09±0.56、1.10±0.35、0.93±0.17、1.09±0.18、1.02±0.24，与对照组比较，5组Collagen-Ⅰ mRNA表达水平差异无统计学意义(P>0.05)；在处理人脐带间充质干细胞6 d后,6组Collagen-Ⅰ mRNA表达水平分别为1.47±0.54、1.45±0.23、1.67±0.29、1.80±0.22、1.99±0.26、1.35±0.22，1.5 h、2.0 h和2.5 h组均高于对照组(P<0.01，P<0.05)。2.5 h组Collagen-Ⅰ mRNA 表达水平显著高于2.0 h组(P<0.01)。

2.7 骨形态发生蛋白(BMP-2)Real-time RT-PCR检测结果 在SEMFs处理人脐带间充质干细胞4 d后，0.5 h组、1.0 h组、1.5 h组、2.0 h组、2.5 h组和对照组人脐带间充质干细胞BMP-2 mRNA表达水平分别为1.11±0.32、0.99±0.16、1.00±0. 16、0.93±0.27、1.09±0.8、0.97±0.23，与对照组比较，5组BMP-2表达水平差异均无统计学意义(P>0.05)；在SEMFs处理人脐带间充质干细胞6 d后，0.5 h组、1 h组、1.5 h组、2 h组、2.5 h组和对照组人脐带间充质干细胞BMP-2 mRNA表达水平分别为1.77±0.54、1.65±0.23、1.87±0.18、2.09±0.33、2.40±0.36、1.75±0.08，其中2.0 h组表达水平高于对照组(P<0.05)，2.5 h组表达水平明显高于对照组(P<0.01)，其余3组与对照组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。2.5 h组表达水平高于2.0 h组(P<0.05)。

3 讨论

干细胞作为一种具有多能分化的细胞，成为再生医学和组织工程医学的种子细胞，人们试图用不同的手段诱导干细胞定向分化，以期找到好的定向分化最佳手段。有文献报道电磁场能促进骨髓间充质干细胞成骨性分化[8]。同时文献报道，低强度、低频电磁场对生物体的影响存在一个效应窗口[9]，因此实验研究了频率50 Hz强度1.8 mT下SEMFs不同处理时间(0.5～2.5 h，间隔0.5 h)对脐带干细胞的影响，研究其是否存在时间效应窗口。首先实验用MTT法测定细胞增殖，然后行Vonkossa和ALP组织化学染色鉴定其成骨性分化，实验研究发现0.5 h组促进人脐带间充质干细胞增殖，而2.0 h和2.5 h组促进人脐带间充质干细胞的成骨性分化。

ALP活性是衡量干细胞成骨性分化的标志性指标，电磁场干预可增强成骨细胞和骨髓间充质干细胞ALP活性已为大量研究所证实[10-11]。因此实验以ALP作为一个衡量指标，检测SEMFs对人脐带间充质干细胞成骨性分化的影响，实验发现每日SEMFs处理2.0 h和2.5 h能增加ALP活性和ALP组织化学染色面积。钙盐作为干细胞成骨性分化的一个重要的指标，实验在成骨性诱导后的不同时间点对人脐带间充质干细胞成骨性进行鉴定，结果发现SEMFs促进人脐带间充质干细胞成骨细胞钙盐的沉积，茜素红染色结果表明2.0 h和2.5 h组显著增加人脐带间充质干细胞钙化结节的数量，实验从细胞形态学水平证明了SEMFs促进人脐带间充质干细胞成骨性分化，同时SEMFs促进人脐带间充质干细胞成骨性分化存在一个时间效应窗口。

研究发现BMP-2具有较强的诱导干细胞成骨性分化能力[12-13], 以及collagen-Ⅰ是干细胞成骨性分化的基础，因此实验检测SEMFs对人脐带间充质干细胞BMP-2和Collagen-Ⅰ mRNA表达水平的影响，实验结果表明SEMFs能促进BMP-2和Collagen-Ⅰ mRNA表达，存在一定的时间依赖性，尤以2.0 h和2.5 h组作用显著。实验研究发现磁场处理特定的时间点，SEMFs能显著促进成骨性分化的相关基因的表达，这可能与当前有人提出的电磁场生物效应窗口理论相一致[14-15]。实验从分子水平表明SEMFs能促进人脐带间充质干细胞成骨性分化，同时存在时间效应窗口。

实验以频率50 Hz强度1.8 mT下不同处理时间(0.5～2.5 h间隔0.5 h)分析了SEMFs对ALP活性、钙盐以及基因表达的影响，证明了SEMFs对人脐带间充质干细胞的成骨性分化，同时存在时间的依赖性。实验的研究结果与已有报道电磁场促进干细胞成骨性分化窗口效应理论结果一致[16]，我们将以本实验结果为基础，进一步从电磁诱导干细胞定向分化机理去研究SEMFs对干细胞分化的影响，为再生医学和组织工程医学应用干细胞定向分化提供一定的实验依据。

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Effect of Electromagnetic Field in Different Treatment Time on Proliferation and Differentiation of Human Umbilical Cord of Mesenchyme Stem Cells in Vitro

ZHOU Jian, MA Xiao-ni, CHEN Ke-ming, YAN Juan-li, GAO Yu-hai, SHI Wen-gui, FANG Qing-qing, XIE Yan-fang

(Osteology Institution, Lanzhou General Hospital of Lanzhou Military Area Command, Lanzhou 730050, China)

Objective To investigate effect of different treatment time of sinusoidal electromagnetic fields (SEMFs) under 50 Hz 1.8 mT on proliferation and differentiation of human umbilical cord of mesenchyme stem cells in vitro. Methods The human umbilical cord of mesenchyme stem cells were isolated in vitro, and randomly divided into 6 groups after one passage. The cell configurations were observed every day under inverted phase contrast microscope; MTT colorimetric assay was used to detect the cell proliferation; ALP activities were detected on 10thd, 12thd, 14thd and 16thd after SEMFs treatment; calcified nodules were stained with alizarin red on 15thd and with vonkossa staining on 17thd after SEMFs treatment; ALP histochemical staining was performed on 13thd after SEMFs treatment; the expression changes of Collagen-Ⅰ and BMP-2 mRNA were detected with real-time RT-PCR (reverse transcription polymerase chain reaction) on 4thd and 6thd after SEMFs treatment. Results The SEMFs promoted the cell proliferation in 0.5 h group; the calcified tendency was found on 10thd-12thd after SEMFs treatment; the ALP activities on 16thd and 18thd after SEMFs treatment in 2.5 h group were significantly higher than those in control group (P<0.05); the areas of alizarin red of calcified nodules in 1.5 h, 2.0 h and 2.5 h groups were significantly larger than that in control group (P<0.01，P<0.05); Collagen-Ⅰ mRNA expression level in 1.5 h group was higher than that in control group (P<0.05), and ALP histochemical staining areas, expression levels of Collagen-Ⅰ and BMP-2 mRNA in 2.0 h and 2.5 h groups were significantly larger and higher than those in control group (P<0.05，P<0.01). Conclusion Sinusoidal electromagnetic fields under 50 Hz 1.8 mT can promote osteoplastic differentiation of human umbilical cord of mesenchyme stem cells in vitro, and the differentiation is the most obvious in 2.5 h group.

Mesenchymal stem cells； Umbilical cord； Electromagnetic fields； Cell differentiation

国家自然科技基金(81270963，81471090);甘肃省科技重大专项资助项目(09ZNKDA025)

730050 兰州,兰州军区兰州总医院骨科研究所

陈克明，E-mail:chkeming@yahoo.com.cn

R329.2

A

2095-140X(2015)03-0011-05

10.3969/j.issn.2095-140X.2015.03.003

2014-10-04 修回时间：2014-12-28)