我国集约化猪场新发猪丁型冠状病毒病的诊断

贺东生，陈小芬，王 飞，苏丹萍，陈瑞爱，尤刘阳

（华南农业大学兽医学院，广东 广州 510642）

猪丁型冠状病毒又称猪德尔塔冠状病毒（PDCoV），是一种新发现的冠状病毒，它主要感染整段小肠，尤其是空肠和回肠，引起严重的肠炎并伴有小猪的腹泻和呕吐[1]。2009—2010年PDCoV在中国香港首次报道该病毒[2-3]。2014年初，在美国首次报道猪群该病的流行，此后至少有19个州有该新型冠状病毒的报道。在美国，猪丁型冠状病毒感染与猪流行性腹泻（PED）和猪传染性胃肠炎（TGE）的临床发病情况比较相似，但是发病症状相对较轻。新型猪肠道冠状病毒病可引起乳猪腹泻和呕吐，发病率和死亡率高达50%～100%，生长猪和成年猪感染后死亡率低。现将本次病例报告如下。

1 材料与方法

1.1 病料

来自华南某集约化猪场（2 000头基础母猪）3～7日龄的乳猪5头，全场乳猪发生严重腹泻，传播迅速，发病率90%、死淘率90%以上。采集发病猪的小肠，按1∶5研磨制备成病料，-80 ℃冻存待检。

1.2 主要试剂

RNA抽提试剂盒购于上海百赛生物科技有限公司，反转录酶、RNA酶抑制剂、dNTP、18T载体克隆试剂盒、DL2000 DNA Marker、胶回收试剂盒、DH5α感受态细胞等购自TAKARA公司。

1.3 引物设计与合成

本实验室根据GenBank所发布的序列号，选择N基因，运用Primer Premier5.0 分别针对PDCoV、PEDV、TGEV、和RTV（猪轮状病毒）设计4对引物，由睿博兴科生物技术有限公司合成，预计扩增的特异性基因片段大小为482 bp、450 bp、810 bp 和 620 bp。

1.4 总 RNA 的提取

病料经离心取上清液，按照ANYGEN核酸提取试剂盒说明书提取病毒总RNA，然后用物RNA酶的水溶解，放在-80℃保存。

1.5 RT-PCR 的检测

反转录体系：ddH2O 4 µL，下游引物 R 1µL，RNA 1µL，70 ℃水浴 10 min 冰浴 2 min ；5×MLV buffer 2µL，ddH2O 1µL，dNTPs 0.5µL，RNA 酶 抑 制 剂 0.25µL，MLV 反转录酶 0.25µL，42 ℃水浴 1 h，72 ℃水浴 15 min冰浴至冷却。

PCR 体 系 ：ddH2O 32.5µL，10×MLV buffer 5µL，dNTPs 4µL，F 2µL，R2µL， cDNA 4µL，rTaq 0.5µL。反 应 条 件 为 94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30Cycles ，72 ℃ 7 min，PCR 反应产物于 1.0% 琼脂糖凝胶电泳。

1.6 克隆

将阳性PCR产物经纯化回收后与PMD-18T载体连接，转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，培养后挑单个菌落进行PCR鉴定，鉴定成功的重组质粒送往睿博兴科生物技术有限公司进行测序。

表1 PDCoV参考毒株N基因序列信息 

1.7 序列分析

将RT-PCR扩增获得的N基因进行克隆、测序，利用MEGA6软件处理，与GenBank上已公布的PDCoV毒株的N基因序列（表1）进行同源性比对分析，并绘制系统进化树。

2 结果与分析

2.1 病猪症状和病变

该集约化猪场5至15日龄乳猪发生传播迅速的严重腹泻，迅脱水死亡，死淘率高达90%以上。症状见剖检病变见图1和图2。主要在小肠,肠管明显扩张,内充满黄色液体,肠壁变薄、松弛、小肠黏膜充血,肠系膜呈索状充血。

图1 发病猪的临床症状

图2 发病猪小肠的病变

2.2 4种病毒N基因扩增

应用RT-PCR方法对样品进行了PEDV/TGEV/RV/PDCoV检测，结果显示PEDV/TGEV/RTV未能扩增出目的条带，而PDCoV扩增出与预期大小一致片段，约482 bp，电泳图见图3。检测结果显示该病料PEDV/TGEV/RTV为阴性，PDCoV为强阳性，说明该猪场可能存在PDCoV的感染。

图3 4种病毒PCR产物电泳图

2.3 PDCoV N 基因序列分析

由测序结果可知，Ch-A测序的N基因中间存在一个核苷酸的缺失、几个突变。运用DNAstard软件将测序正确PDCoV N基因序列与GenBank上已发表的国内外毒株N基因参考序列进行同源性比对分析，结果显示获得PDCoV毒株N基因之间的核苷酸序列同源性为98.3%到100%，氨基酸序列同源性为95.0%到100%；其中TX与中国已公布毒株相比核苷酸同源性为98.3%到99.0%，氨基酸同源性为95.0%到96.9%，显示与中国香港毒株HKU15-155同源性最低；与韩国和美国毒株相比核苷酸同源性为98.8%～99.0%，氨基酸同源性为96.2%到96.9%（结果见图4、图5）。

2.4 PDCoV N 基因遗传进化分析

运用MEGA 6.06软件绘制N基因系统进化树，结果表明我国新出现的猪丁型冠状病毒（Ch-A）与国内外报道的猪丁型冠状病毒亲缘关系较远，它单独在一个新的分支上。说明这是在我国新发现的一个新毒株（结果见图6）。

3 讨论

自2013年至今，新出现的PEDV和PDCoV已遍布美国，造成大量猪死亡。目前国际上正在形成该病毒相关研究热点，也发表了少量的报告。但国内至今未见该病毒为主因在猪场暴发和流行的报道。

我们首次报道了国内集约化猪场暴发猪丁型冠状病毒病。通过设计4对冠状病毒引物，在检测PEDV、TGEV和RTV为阴性后，进一步设计引物扩增PDCoV，显示为强阳性。对PDCoV HN株的N基因进行测序，并与国内外已公布的序列进行系统进化树分析，结果显示：该PDCoV毒株（Ch-A）与GenBank上公布的美国株及中国株不在一个分支上，是新发现的一株新型冠状病毒病。该分支的毒株是否与本次发病的高致病力有关值得深入研究。仍然未知该病毒是怎么传入我国及其在我国各地的感染情况。

老病未消除、新病涌现，需高度重视和立即加强研究对猪丁型冠状病毒的监测和系统性研究，降低给养猪业带来的损失和威胁。

图4 PDCoV N基因核苷酸序列同源性比较

图5 PDCoV N基因氨基酸序列同源性比较

图6 我国新出现的与国内外现有的猪丁型冠状病毒N基因的系统进化树

[1] Opriessnig T.Re-emergence of porcine epidemic diarrhea virus in the global pig population[J]. The Veterinary Journal, 2015.204(2):131.

[2] Lee S，Lee C.Functional characterization and proteomic analysis of the nucleocapsid protein of porcine deltacoronavirus[J]. Virus Research, 2015.208:136-145.

[3] Wang L,Byrum B，Zhang Y.Detection and Genetic Characterization of Deltacoronavirus in Pigs,Ohio,USA, 2014[J]. Emerging Infectious Diseases, 2014. 20(7).