荧光共振能量转移技术在肿瘤研究中的应用进展

陈 玉综述，徐方平，刘艳辉审校

0 引 言

随着后基因组时代的到来，人类的研究重点从基因组图谱深入到功能基因组的领域。基因表达产物-蛋白质参与了生物体内几乎全部的生命活动，而蛋白质-蛋白质相互作用在整个机体生理和病理过程中起到至关重要的作用。近年来，肿瘤基因组学、靶向治疗等方面的研究显著扩大了蛋白质-蛋白质相互作用在肿瘤治疗中的应用。大量的基础及临床研究用于确定蛋白质-蛋白质作用网络关系，以明确诱导及维持肿瘤细胞转化的关键枢纽及节点，而这些关键的枢纽及节点有望成为肿瘤诊断、预后预测及靶向药物治疗的分子标志物［1］。传统研究蛋白质-蛋白质相互作用方法有酵母双杂交系统、免疫共沉淀、Western blot 等，但这些方法都破坏了细胞的自然状态，无法反映活细胞生理条件下蛋白质-蛋白质相互作用的时空动态信息，也无法进行蛋白质亚细胞定位。近年来荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer，FRET)技术的研发解决了以上问题。FRET 通过非辐射能量转移原理，可以定时、定量、定位、动态地观察活细胞内蛋白质与蛋白质之间的相互作用［2］。FRET 技术在生物、化学、医学等众多领域中得到快速发展，应用日益广泛。2013 年Science 报道了结合FRET 与超宽带超速紫外线二维光谱仪，捕捉到肌红蛋白中色氨酸与亚铁血红素之间的瞬时超速电子转移，有助于研究蛋白质中色氨酸介导的电子转移，从而扩大了FRET在蛋白质结构及动力学如蛋白质折叠等研究中的应用［3］。文中就FRET 技术的原理及应用，尤其是在肿瘤研究中的应用作一综述。

1 FRET 的技术原理

FRET 指的是2 个荧光团之间的能量转移。当2 个荧光发射基团足够靠近时，作为能量供体的分子吸收了一定频率的激发光后激发到更高的电子能态，通过振荡偶极子作用将能量转移给处于基态的作为能量受体的分子，发生了能量转移［4］。FRET发生需有以下3 个必要条件:首先，2 个荧光团之间距离必须足够近，一般为1 ～10 nm;其次，供体与受体之间存在适当的定位方向;第三，供体的发射光谱与受体的激发光谱(又称吸收光谱)之间必须有相当程度的重叠［5］。FRET 的效率(E)是指供体经FRET 转移给受体的能量占供体释放总能量的比例，E 的计算公式为:

(Ro 为Förster 距离常数，R 为供体与受体的实际距离)

其中相当于受体接受50%FRET 能量时与供体的距离，与供体及受体本身特性、媒介的折射指数、供体发射光谱与受体激发光谱重叠程度、供体与受体相对定位角度等相关，通常为2 ～8 nm［6］。由此可见，FRET 的效率主要依赖于供体与受体的距离及相对定位。

尽管FRET 理论早在20 世纪已提出，但这项技术在活细胞中的应用是在1992 年首次从一种学名为Aequorea victoria 的水母中克隆出完整的绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)基因后才大力发展起来的［7］。因GFP 具备发光无需辅助因子及作用底物，易于在活细胞内稳定表达，且与之构建的融合蛋白在活细胞内仍正常行使功能等特性，故成为一个极佳的在活细胞内观察蛋白质-蛋白质相互作用的报告分子。近年来发展出多种GFP 的突变体，可发出不同颜色的荧光，其中应用最广的是青色荧光蛋白(cyan fluorescent protein，CFP)和黄色荧光蛋白(yellow fluorescent protein，YFP)。CFP 的发射光谱与YFP 的吸收光谱有相当程度重叠，可参与融合蛋白的构建。当2 个分别融合了CFP、YFP的蛋白相互作用时，所融合的CFP、YFP 随之相互靠近，激发CFP 吸收波长433 nm 的激发光后发生FRET，检测到波长为527 nm 的YFP 荧光。

2 FRET 的应用

FRET 可实时检测2 个生物大分子间的相互作用，也可研究分子内部变化，因此在生物医学中应用广泛，其在活细胞水平研究蛋白激酶活性、蛋白质磷酸化、蛋白质构象、钙离子浓度测定及蛋白质之间的相互作用都有应用。而在肿瘤的研究中，分子机制、信号传导通路已成为研究热点，人们认为肿瘤基因信号转导通路中的信号分子很可能成为抗癌药物的作用靶点，基于FRET 原理设计的生物传感器可将活细胞内信号分子的作用活性可视化，更助于活细胞内信号通路的研究［8］。因此，在肿瘤诊断、预后及靶向药物治疗等领域的FRET 应用也越来越多。2.1 FRET 在肿瘤基础研究中的应用 蛋白激酶是大多数生物信号通路的核心，在许多肿瘤的病理机制中起至关重要的作用。最近，荧光报告分子与基于FRET 原理设计的生物传感器的发展为在生理条件下观察蛋白激酶活性及动态行为提供了大量成像方法，可达到实时、高时空分辨率及不破坏其自然生理结构及功能条件下检测蛋白激酶活性。荧光生物传感器可用于研究生理及病理状态下蛋白激酶的活性、结构及功能。应用FRET 原理，Zhang 等［7］设计出几种基因编码的探针用于研究蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)、Src、Abl、表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)等4 种已知酪氨酸激酶的活性。这种探针包含一个相关蛋白激酶特异的底物结构域，一个与底物相结合的磷酸化识别结构域，以及两端分别相连CFP、YFP 或其变异体。当底物磷酸化后，分子内底物结构域与磷酸化识别结构域相结合，两端的CFP、YFP 靠近产生FRET。在生长因子刺激诱导下，以上几种酪氨酸激酶被激活，利用FRET 探针可检测到25%～35%的活性变化。

然而，敏感的FRET 生物传感器由于设计困难，阻碍了FRET 在肿瘤研究中的广泛应用。FRET 效率不仅与受体、供体间的距离相关，还与两者相对位置有关，在依赖距离的模型中，传感器与配体结合导致FRET 增加;在依赖相对位置的模型中，传感器与配体结合之前FRET 已经增高，来源于GFP 的荧光蛋白易于相互形成二聚化物，而这种二聚化作用会加强FRET 效应［9］。由于缺乏FRET 生物传感器的三维结构，很难预测何种模型会占主导地位。Komatsu 等［10］设计了一个较长的连接传感器与配体结构域的连接器(EV 连接器)克服了以上困难。EV连接器由116 个氨基酸组成，可消除荧光基团的二聚化作用，使FRET 效率主要依赖距离。该研究促进了FRET 技术在激酶及三磷酸鸟苷酶中的应用，帮助破译活细胞内信号分子的作用。Kazuhir等［11］在此基础上改进了多种FRET 生物传感器的设计，使其监测癌基因产物的活性效果更佳。如为检测Ras 活性的FRET 生物传感器Raichu-Ras，其显示在表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)诱导下板状伪足上的Ras 活性增高，且受体YFP/供体CFP 的比值反映了FRET 效率。生物传感器Prin-c-Raf 可监测与Ras 结合诱导的c-Raf 构象改变，且FRET 效率与c-Raf 活性呈负相关，由此可观察到c-Raf 在细胞质膜上的分布及构象变化。Picchu-CrkII 同样用于监测CrkII 致癌基因产物的构象改变。CrkII 是EGFR 的底物，在EGF 刺激的作用下可观察细胞质膜上CrkII 磷酸化作用广泛地增加，因此，通过观察CrkII 磷酸化水平可反映EGFR活性。该研究团队还设计了几种新的FRET 生物传感器以检测丝氨酸/苏氨酸激酶活性，如RSK、S6K、AKt、PKC 等，其中S6K 可有助于mTORC1 信号通路活性的可视化［10］。

同理，Kumagai 等［12］设计了检测细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)活性的FRET 生物探针，并建立表达该探针的小鼠乳腺肿瘤病毒(mouse mammary tumor virus，MMTV)-Neu 转基因小鼠模型，后者常用于人类表皮生长因子受体2(human epidermalgrowth factor receptor-2，HER2)/Neu 阳性的乳腺癌研究，而HER2/Neu 的转录生长信号主要通过Ras-Raf-MEK-ERK 信号通路调控。该研究发现ERKhigh的细胞在体内、体外均较ERKlow细胞成瘤速度慢，推测高ERK 活性可能抑制乳腺癌干细胞的自我更新。

FRET 不仅可以用于蛋白质间相互作用的研究，还可用于研究DNA、RNA 间的相互作用。Huang等［13］首次利用双链RNA 作为FRET 探针，定量检测健康人及肿瘤患者血清中的位点特异性核糖核酸酶A(RNase A)活性，发现胃癌、肝癌、胰腺癌、食管癌、卵巢癌、宫颈癌、膀胱癌、肾癌及肺癌患者血清中RNase 活性显著降低，而乳腺癌、结肠癌患者则轻微降低，从而推测RNase A 将来有可能作为检测某些特定肿瘤的生物标记，帮助肿瘤的早期诊断。

细胞内复杂的生命活动是通过蛋白质-蛋白质作用网络来调节的，该网络常常是2 个以上的多种蛋白质之间相互作用。最近发展起来的三色FRET技术(three-chromophore FRET)可研究3 种不同蛋白质之间的相互作用。三色FRET 技术是通过将3 种荧光蛋白分别标记3 个不同的生物分子，观察到3 种荧光蛋白之间连贯发生2 次FRET 过程，从而推测3 个生物分子之间的相互作用关系。这一技术方法有助于研究更为复杂的蛋白质相互作用关系。Lopez-Gimenez 等［14］利用连续三色FRET 技术研究证实肾上腺素受体α1b(G 蛋白偶联受体)是以高阶寡聚物的形式而不是二聚化形式存在，其寡聚化效应与受体蛋白成熟、质膜表面传递以及信号传导功能相关。跨膜区Ⅰ及跨膜区Ⅳ共同突变为显著负效应突变体，而仅有跨膜区Ⅰ突变不足以产生负效应，跨膜区Ⅳ单独突变则可阻碍质膜表面信号传递。

2.2 FRET 在肿瘤诊断及药物研发中的应用 除了在以上这些基础研究中的应用，基于FRET 原理的荧光生物传感器还为肿瘤早期诊断、疾病进展、监测治疗反应、高通量筛查候选药物及评估药物成分等研究提供了强有力的工具。Mizutani 等［15］首次将基于FRET 原理设计的可检测BCR-ABL 激酶活性的基因编码生物传感器应用于临床。CrkL 是BCRABL 酪氨酸激酶的底物，其磷酸化在癌基因信号转导中起到重要的作用，具有致癌潜能［16］。甲磺酸伊马替尼(imatinib mesylat，IM)为一种经过认证的酪氨酸激酶抑制剂，可阻碍BCR-ABL 的ATP 结合位点，用于费城染色体阳性慢性髓细胞性白血病(chronic myeloid leukemia，CML)的治疗［17］，但CML加速期或急变期患者易出现耐药，目前对耐药机制的研究认为是ABL 激酶结构域的点突变阻碍了其与分子靶向药物的结合［18］。因此，对于IM 治疗无效的患者应及时应用第二代治疗药物如尼罗替尼(nilotinib，NL)、达沙替尼(dasatinib，DS)等［19］。Mizutani 等［15］构建了一个包含CrkL 的蛋白，其中CrkL 两端分别连接Venus(YFP 的变异体)及增强型CFP。当BCR-ABL 存在时，CrkL 的SH2 结构域在分子内与磷酸化的酪氨酸(Y207)结合，其两端的Venus 及CFP 距离靠近，FRET 效应增强。该融合蛋白可用于检测IM 抑制BCR-ABL 激酶活性的效能，IM 导致FRET 效能的减少是剂量依赖性的，当IM的浓度≥0.1 μmol/L 时，即可观察到FRET 效应显著减少。而用免疫印迹或流式细胞仪方法检测内源性CrkL 磷酸化状态时，要求IM 的浓度至少达到0.5 μmol/L 才能观察到显著性差异。应用延时双重发射荧光显微镜可显示IM 治疗期间FRET 效应减少的时间动态改变，24 h 后大部分细胞内FRET 效应已被IM 完全抑制。因此，应用FRET 方法及生物探针评估CML 分子靶向治疗药物的效果是高度敏感且实用的。将缺乏BCR-ABL 表达的细胞(293F)的FRET 平均发射比值(D-FRET)作为阈值，低于该值的细胞称为FRETlo，高于该值的细胞称为FREThi。通过观察表达BCR-ABL 的CML 细胞群中FREThi细胞的比例可帮助及时发现耐药细胞及筛选第二代治疗药物。FRET 方法可评估单个细胞中药物的直接效应，而免疫印迹、流式细胞仪等方法需要固定、溶解或透化细胞，可能导致BCR-ABL 蛋白快速降解从而低估了BCR-ABL 蛋白水平，FRET 可检测生理状态下的活细胞内BCR-ABL 蛋白状态。该研究还发现带有G250E 点突变的BCR-ABL 蛋白对NL 的敏感性是依赖其剂量浓度的，从而可以解释O'Hare等［20］研究发现G250E 点突变对NL 敏感而Redaelli等［21］的研究结论却与之相反的争议［16］。因此，应用FRET 原理及FRET 生物探针方法可用于CML 的诊断、监视抗癌药物的治疗反应及耐药细胞的检测，并进一步用于直接评估激酶抑制剂效应，帮助预测采用第二代抑制剂或新的针对耐药突变治疗药物的种类与时间。近年来，FRET 技术也陆续用于其他肿瘤的药物研发如胰腺癌［22］、乳腺癌［12］等。

2.3 FRET 联合其他技术在肿瘤研究中的应用FRET 还可与其他技术结合，如聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)、流式细胞仪技术、生物发光共振能量转移、近红外技术等，扩大其应用领域。以下简单介绍几种FRET 与其他技术结合在肿瘤发生发展中的应用。

DNA 甲基化是一种调节转录的表观遗传修饰，启动子区域的异常甲基化经常发生于富于CG(又称CpG 岛)的片段，可干扰基因转录并直接导致基因沉默。这种甲基化常发生于抑癌基因的启动子区域，不仅与肿瘤发生相关，还与肿瘤分级、分期、复发、转移等预后有关。而这一表观遗传学改变发生于肿瘤形成之前，可视为一种潜在的生物标记物，并可应用于肿瘤的预防和治疗［23］。随着表观遗传学修饰方法在骨髓增生异常综合征治疗中的应用已通过FDA 认证，检测抑癌基因启动子区域异常高甲基化状态已成为癌症早期诊断、监测肿瘤进展及靶向治疗的工具。Bailey 及其研究团队将高特异性的甲基化特异性PCR(methylation specific PCR，MSP)与高灵敏度的量子点荧光共振能量转移(quantum dot FRET，QD-FRET)结合，形成甲基化特异性的量子点荧光共振能量转移(methylation specific quantum dot FRET，MS-qFRET)方法，可定性和定量地检测甲基化DNA［24］。在MS-qFRET 中，经亚硫酸氢钠处理的DNA，未甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不发生转变，通过PCR 扩增，其中正向引物经过生物素化，逆向引物标记了有机荧光团Cy5，与链亲和素结合的量子点可捕捉标记的扩增产物，量子点作为供体，将能量转移给经扩增后与产物融合的受体Cy5，因此，根据FRET 水平可确定DNA 甲基化状态。在此研究中，P15INK4B启动子甲基化状态可作为急性髓细胞性白血病的预测及预后指标，且与FRET 效能呈直线相关，应用MS-qFRET 方法可检测DNA 丰富的样本如肿瘤组织或细胞株中的P15INK4B甲基化状态，也可用于DNA 稀少的样本如血清、唾液中P15INK4B甲基化状态的检测。因此，MS-qFRET 在临床诊断、预后方面的应用具有巨大的潜力。

近红外技术是指利用生物组织对700 ～900 nm近红外区光子量吸收最弱，近红外光可穿透组织层，从而对深部肿瘤成像。由于其在生物组织内较少吸收和辐射，将近红外染料与FRET 技术结合，较其他荧光染料优势明显。NF-κB 蛋白是一种转录调节因子，其家族蛋白在细胞增殖及抑制凋亡中发挥重要作用［25］。NF-κB 信号通路的激活主要依赖于p50蛋白的活化［26］。利用近红外染料Cy5.5 和Cy7 分别作为供着和受者与双链寡聚核苷酸探针连接，后者可与p50 蛋白特异结合，当p50 蛋白加入后，可观察到FRET。从而可研究p50 蛋白与寡核苷酸的相互作用。

FRET 与实时PCR 结合，可同时对滤泡性淋巴瘤标本中BCL-2 基因重排、MBR/JH 易位进行定性和定量检测［27］。利用FRET 探针进行PCR 扩增，并结合SYBR GreenⅠ荧光蛋白溶解曲线分析，可快速、简单、有效地检测出骨髓或外周血中的肿瘤细胞，有助于评估患者肿瘤进展及治疗情况。

3 展 望

综上所述，FRET 技术已在生物医学的基础研究、疾病诊断(尤其是恶性肿瘤的早期发现)、药物研发等方面有广泛的应用，但其本身仍存在一些挑战，如生物传感器的设计、高效转染表达稳定的细胞、FRET 存在背景噪声需要校正的问题等，特别是FRET 要求发生于特定相对位置且距离在1 ～10 nm的荧光基团间，这一严格要求有可能产生假阴性现象，如2 个生物分子相对位置不合适或作用距离﹥10 nm 等。目前已有许多研究针对以上问题提出各种解决方法，使FRET 的应用得到重大的进展。相信随着对肿瘤信号通路、信号分子活性的研究进展，FRET 在活细胞水平揭示肿瘤信号通路尤其是下游蛋白水平相互作用关系等方面的地位越来越突出，从而帮助阐明肿瘤发病机制、耐药机制，因此在肿瘤的早期发现及药物研发中拥有巨大的潜力。通过EGFR-Ras-ERK、mTOR［10］、Cdk 家族［28］等信号通路的研究，FRET 将用于更多的恶性肿瘤如肺癌、淋巴瘤的药物研发。在药效监测方面，FRET 可用非侵入性样本如血清检测相关生物标记物活性以便早期发现耐药及筛选药物，因此拥有广大的临床应用前景。

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