C3a 分泌性表达载体及过表达C3a 肾小管上皮细胞株的构建

郑敬民，尹 广，恽时锋，赵文紧

0 引 言

补体系统的不适当激活也会导致组织的损伤。越来越多的研究表明，补体系统参与了多种人类疾病的发生、发展过程［1-4］。补体活化与包括糖尿病肾病在内的多种病变相关［5-7］。但有关补体系统参与糖尿病肾病等肾组织损伤的机制仍未明了。膜攻击复合物的形成是各种补体活化通路的最终结果。通过形成膜攻击复合物，活化的补体系统可导致组织细胞的破坏损伤。但除了最终的膜攻击复合物，在各种途径的补体活化过程中，还产生了一系列被称作过敏毒素的补体成分小片段(包括C3a、C4a 和C5a，分别由C3、C4 和C5 裂解产生)，它们也可能参与糖尿病肾病等肾组织损伤过程。但目前对于各种过敏毒素在肾组织损伤中的确切病理作用和意义仍不清楚。为了探讨过敏毒素在肾组织损伤中的可能作用，本文设计构建了最为重要的过敏毒素——C3a的分泌性表达载体，并将其导入到HK2 人肾小管上皮细胞构建了分泌性高表达C3a 的人肾小管上皮细胞株HK2-C3a，为探讨C3a 在肾小管上皮细胞中的生理功能和病理意义提供了很好的细胞模型。

1 材料与方法

1.1 C3a 分泌性表达载体的构建及重组慢病毒包装和制备 基本过程如下:根据人C3 mRNA 序列和人IL-6 mRNA 序列，设计合成C3a 分泌表达重组基因(即IL-6 信号肽编码序列(NM_000600.3 中的117-203 部分)+C3a 编码序列(NM_000064.2 中的2076-2306 部分)。将其克隆到慢病毒表达载体pLenti6.3-MCS-IRES2-EGFP 的多克隆位点，构建成C3a 慢病毒分泌性表达载体pLenti6.3-C3a-IRES2-EGFP，经测序验证正确后，用构建的慢病毒表达载体pLenti6.3-C3a-IRES2-EGFP 和包装质粒(packaging mix)共转染293 T 细胞，包装成C3a 表达重组慢病毒。收集病毒原液，超速离心浓缩，并测定滴度，-80 ℃冰箱保存备用。C3a 分泌性表达载体的构建和慢病毒包装由Invitrogen 公司提供服务。

1.2 人肾小管上皮细胞系HK2 的来源和培养HK2 人肾小管上皮细胞由美国ATCC 引进，现保存于我们实验室。HK2 细胞以含10%胎牛血清的1640 培养基于37 ℃，5%CO2孵箱中培养。细胞每3 天换液1 次，长至约80%以1∶4 进行传代。

1.3 基因转染、药物筛选和稳定转染单克隆细胞株的构建 转染前1 d，将HK2 细胞以1×105个/孔的密度接种于24 孔板。经37 ℃，5% CO2孵箱培养24 h 后，将含C3a 表达重组慢病毒的溶液冰上融解，按MOI 值为5 的比例用培养液稀释病毒，并加入终浓度为8 μg/mL 的Polybrene，轻轻混匀后加入到细胞中。培养箱中孵育6 h 后，换上新鲜的培养基继续置孵箱培养。24 h 后将细胞置荧光显微镜下观察，根据转染细胞能发出绿色荧光的特点判断转染是否成功。转染48 h 后，消化细胞，以1∶6 的比例重新接种于细胞培养瓶，并加10 μg/mL 的杀稻瘟菌素筛选稳定转染细胞，持续筛选14 d，期间每3 天换液1 次。此后，以稀释法筛选C3a 稳定转染单细胞克隆，构建成C3a 分泌性表达HK2 细胞株。

1.4 细胞总RNA 的提取和cDNA 合成 细胞总RNA 的提取采用TRIZOL 试剂(Invitrogen 公司产品)，cDNA 合成采用Tarkara 公司的“PrimeScript RT Master Mix(Perfect real time)”逆转录试剂盒，具体操作按试剂盒说明进行。

1.5 C3a mRNA 表达的荧光定量PCR 分析 分别根据重组分泌性表达C3a 基因序列(见1.1 部分)和18S RNA 序列(Homo sapiens RNA，18S ribosomal 5(RNA18S5)，ribosomal RNA，NR_003286.2)，利用DNASIS v2.5 Demo 软件设计C3a 引物和18S RNA 引物，由金唯智生物科技有限公司合成引物。引物序列分别为:人C3a sense:5'-aag tcg gca agt acc cca ag-3';人C3a antisense:5'-agt tgc agc agt cca gga ag-3';人18S RNA sense:5'-ttt ctc gat tcc gtg ggt gg-3';人18S RNA antisense:5'-agc atg cca gag tct cgt tc-3'。荧光定量PCR 分析采用Tarkara 公司的“SYBR Premix Ex Taq II Tli RNaseH Plus”试剂盒，以18S RNA 为内参于ABI 公司的7900 型荧光定量PCR 仪上进行。PCR 扩增条件是95 ℃1 min，95 ℃15 s，60 ℃30 s，40 个循环。

1.6 C3a 表达水平的检测方法 根据转染细胞分泌性表达C3a 的特点，利用人C3a ELISA 试剂盒(Human C3a ELISA Kit，BD 公司，Cat.No.55049)检测细胞培养上清中C3a 的浓度，了解转染细胞C3a 分泌性表达水平。

1.7 统计学分析 采用SPSS 10.0 软件进行统计分析。定量资料以均数±标准差表示，两组均数的比较视方差齐性检验(以0.1 作为检验水准进行Levene 检验)结果，方差齐时采用两独立样本t检验，方差不齐时采用Satterthwaite 校正t 检验，以P≤0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 C3a 分泌性表达慢病毒表达载体的设计、构建和鉴定 C3a 分泌性表达慢病毒载体的构建过程见图1。对于构建成的C3a 慢病毒表达载体pLenti6.3-C3a-IRES2-EGFP，进行了全序列测序验证，结果显示所构建的表达载体的序列完全正确，说明C3a 慢病毒表达载体构建成功，部分测序结果见图2。

图1 C3a 分泌性表达慢病毒载体pLenti6.3-C3a-IRES2-EGFP 的构建过程示意图Figure 1 The construction process of C3a secretory expression vector pLenti6.3-C3aR-IRES2-EGFP

图2 C3a 分泌性表达慢病毒载体pLenti6.3-C3a-IRES2-EGFP 的部分测序结果Figure 2 Sequencing result of C3a secretory expression vector pLenti6.3-C3aR-IRES2-EGFP

2.2 C3a 过表达慢病毒的包装 以构建的C3a 慢病毒表达载体和包装质粒(pLP1、pLP2 和pLP/VSVG)共转染293 T 细胞，48 h 后收集细胞培养上清，经分级离心和滴度测定，最后得到了滴度约为5×108个/mL 的慢病毒液。见图3。

图3 镜下观察C3a 重组慢病毒液感染的HEK 293 细胞Figure 3 Observation of HEK293 cells infected by C3a recombinant lentivirus under microscopy

2.3 HK2 细胞慢病毒转染及稳定转染细胞株的筛选 将C3a 重组慢病毒转染HK2 人肾小管上皮细胞，24 h 后，荧光显微镜下即可观察到绿色荧光蛋白的表达，至转染后48 h 转染细胞内的绿色荧光蛋白表达更强。为了获得稳定转染的细胞株，我们将细胞消化重新辅板，同时根据C3a 慢病毒表达载体中带有杀稻瘟菌素抗性基因的特点，于细胞培养基中加入杀稻瘟菌素以杀死除稳定转染以外的其他细胞。经过2 周的连续加药筛选，得到了稳定转染C3a 重组慢病毒的细胞，在此基础上，利用连续稀释方法，进一步筛选出了稳定转染C3aR 重组慢病毒的细胞克隆，进而构建成了稳定转染细胞株HK2-C3a，见图4。

2.4 HK2-C3a 细胞株中C3a 的表达分析结果 利用荧光定量PCR 方法对HK2-C3a 细胞株中C3a mRNA表达水平进行分析，与作为对照的正常(非转染)HK2 细胞相比，HK2-C3a 细胞株中C3a mRNA 表达水平显著升高［(1.0±0.5)vs(1 321.0±181.0)］。基于ELISA 检测的结果显示，HK2-C3a 细胞培养上清中C3a 的水平比HK2 细胞培养上清中显著升高［(0.3±0.2)ng/mL vs(249.0±37.0)ng/mL］。

图4 稳定转染C3a 重组慢病毒的HK2 细胞株的构建结果Figure 4 Construction of HK2 cell strain stably transfected by C3a recombinant lentivirus

3 讨 论

越来越多的证据表明，补体系统不仅是人类防御系统的重要组成部分，而且还是人类多种疾病的重要致病因素。有关补体系统的不当激活在人类疾病中的作用已引起了不少研究者的关注，成为了多种人类疾病机制研究的一个重要新热点［1-4，8］。虽然人们早就认识到包括糖尿病肾病、膜性肾病和狼疮性肾炎在内的多种肾脏疾病患者肾组织中均存在补体过度活化现象，但对于补体系统在肾组织损伤中的确切作用和参与肾组织损伤的确切分子机制的认识却仍然很有限。

理论上，补体的过度活化可以多种方法参与肾脏疾病的发生发展过程。但长期以来，人们对补体活化致组织损伤作用的关注更多的是集中于膜攻击复合物的效应。但在补体的链式激活过程中，同时产生了包括C3a 在内的一系列小片段分子，它们被释放到周围微环境中，参与了对机体细胞功能的各种调节。作为一种重要的促炎因子，C3a 可通过与其受体C3aR 的作用趋化和激活白细胞，促进白细胞脱颗粒和分泌各种炎症因子［9-12］。而近年来的研究表明［8］，除了广泛表达于各种免疫细胞外，C3aR 还表达于包括脑、肝、肺、肾在内的多种器官中的组织细胞，且在不同的组织细胞和不同生理病理情景中表现出多种多样的重要功能。在肾中，C3aR主要表达于上皮细胞(包括肾小管上皮细胞、肾小球足细胞和壁层上皮细胞)［13-14］，但目前对于C3aR的生理功能和各种病理情景下的病理意义仍不清楚。考虑到多种肾病患者肾组织中存在的补体过度活化现象(意味着有大量的C3a 会被释放出来并可能激活肾组织细胞中的受体C3aR)、C3a/C3aR 轴过度活化在一些组织细胞中所表现出来的包括影响细胞发育分化、细胞增殖或凋亡等在内的重要功能［15-20］、以及肾小管损伤在糖尿病肾病等肾疾病中的重要性，我们推测:C3a/C3aR 轴过度活化很可能在肾小管上皮细胞损伤中有重要作用。为探讨C3a/C3aR 轴过度活化在肾小管上皮细胞损伤中的病理意义，本研究构建了分泌性过表达C3a 人肾小肾小管上皮细胞株。我们首先设计合成了C3a 分泌性表达单元，并成功地将其克隆到了慢病毒表达载体pLenti6.3-IRES2-EGFP 的多克隆位点，经全序列测序验证，得到序列完全正确的慢病毒表达载体pLenti6.3-C3a-IRES2-EGFP。在此基础上，利用293 T 细胞进行了重组慢病毒的包装，并得到了高滴度的C3a 重组慢病毒。利用C3a 重组慢病毒，对人肾小管上皮细胞系HK2 进行了转染试验，经药物筛选和稀释法克隆得到了稳定转染了C3a 重组慢病毒的HK2 细胞株HK2-C3a。进而利用荧光定量PCR和ELISA 方法对HK2-C3a 细胞株C3a 的表达和分泌情况进行了分析，结果证实C3a 在HK2-C3a 细胞株中的分泌性高水平表达，成功构建了分泌性过表达C3a 的人肾小管上皮细胞株。特别是在表达载体的设计构建过程中，我们充分考虑到了过敏毒素C3a 基因的特殊情况。由于C3a 只是补体C3 的一个片段，在人和各种动物的基因组中并不存在单独的C3a 基因(只有C3 基因)。如果我们直接克隆天然的C3 基因用于构建表达载体，则要增加C3a 的水平还需想办法激活补体C3 而使其裂解，这样不仅比较麻烦，而且同时还会产生其他补体活化产物(比如C3b)而使问题复杂化，不利于下游进一步的对C3a 在肾组织细胞中作用的研究。因此本研究根据C3a 编码序列进行了C3a 表达单元的人工合成来避免上述问题，其优点显而异见。而为了使表达合成的C3a 能高水平地分泌到细胞外C3a 主要通过与其受体C3aR(位于细胞膜上)的结合而发挥生物学功能，又特别在C3a 编码序列的上游增加了IL-6 基因的信号肽序列。从对人肾小管上皮细胞的转染试验来看，成功实现了转染后C3a 的高水平分泌性表达。

C3a 分泌性表达载体的成功构建对于进一步探讨C3a/C3aR 轴在相关细胞中的正常生理和特定病理情况下的病理意义和相关分子机制极为有用。就HK2-C3a 细胞株来说，可通过比较HK2-C3a 细胞与正常HK2 细胞在形态、结构和功能上的差异了解C3a/C3aR 轴在人肾小管上皮细胞中的生理功能;通过比较HK2-C3a 细胞与正常HK2 细胞基因表达谱和相关信号通路水平的差异，了解C3a/C3aR 轴作用的分子机制;通过分析高糖、氧化应激、炎症等因素对HK2-C3a 细胞与正常HK2 细胞影响的差异，探讨上述特定病理条件下C3a/C3aR 轴的病理意义和分子机制。当然，也可利用本研究构建的C3a 慢病毒转染足细胞、成纤维细胞、内皮细胞、系膜细胞，以及其他各种细胞，观察分析C3a/C3aR 轴在这些细胞中的生理和特定病理条件下的意义。总之，研究不仅为进一步研究各种病理情况下C3a/C3aR 过度活化在人肾小管损伤中的作用和意义，探讨活化补体通过激活C3aR 致肾小管上皮细胞损伤的作用和分子机制提供了很好的细胞模型，所构建的重组C3a 慢病毒也为进一步开展C3a 对其它细胞的作用和病理意义创造了条件。本文构建的表达载体和细胞株也有不足之处，即转基因C3a 是以组成型方式表达，如能以可诱导型方式对转基因的表达水平进行很好的调控，则对于更精细地研究C3a/C3aR 轴功能更为有利。

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