1 型糖尿病大鼠血清氧化应激状态及VEGF 水平分析

冯琳琳，蒋红梅

0 引 言

越来越多的研究表明，糖尿病患者体内可能存在不同程度的氧化应激紊乱，且高水平的血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)可能与糖尿病尤其以微血管病变为基础的糖尿病并发症的发生有关［1-2］。近年来，国内外关于糖尿病氧化应激发病机制的研究很多，但由于研究人群的不同，患者受饮食、生活环境、所处病程、药物治疗等因素的影响，使得糖尿病患者体内受到的氧化损伤也不尽相同，各文献报道不尽一致［3-6］。因此建立较理想的动物模型来研究糖尿病氧化应激的相关问题尤为必要。

本研究通过给大鼠注射一定剂量的链脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)建立1 型糖尿病(type 1 diabetes mellitus，T1DM)模型，检测血清氧化应激指标，包括谷胱甘肽(Glutathione，GSH)、超氧化物歧化酶(super-oxide dismutase，SOD)、总抗氧化能力(total anti oxidation capacity，T-AOC)和丙二醛(Malondialdehyde，MDA);测定血清VEGF 水平，观察糖尿病发生发展过程中机体氧化、抗氧化能力及VEGF 水平的变化。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康清洁型SD 大鼠，雄性，40 只，体重180 ～220 g，由第三军医大学大坪医院实验动物中心提供。实验动物合格证号:SCXK(渝)2012-0001。实验前尾静脉采血测定大鼠空腹血糖，血糖在3.0 ～5.0 mmol/L 者入选［7］。入选大鼠随机分为2组:T1DM 组(n=23)，对照组(n=17)。分笼喂养，每笼3 ～5 只，自然光照，室温(15 ～26 ℃)，湿度保持在50%左右，大鼠自由饮水摄食。饲料成分包括碳水化合物60%、蛋白质22%、脂肪10%、其他8%(贵阳医学院动物中心提供)。

1.2 试剂与仪器 STZ 100 mg/支，购于Sigma 公司;MDA、GSH、T-AOC、SOD 检测试剂盒购于南京建成生物公司;鼠VEGF ELISA 检测试剂盒购于上海西唐生物科技有限公司。罗氏血糖仪、BIO-RAD xMark 全自动酶标仪购自美国伯乐BIO-RAD 公司。

1.3 方法

1.3.1 复制动物模型 大鼠适应性喂养1 周，禁食16 h 后，按55 mg/kg 的剂量腹腔注射1%STZ 柠檬酸溶液。72 h 后，尾静脉全血血糖≥16.7 mmol/L，为糖尿病动物模型造模成功［8］。对照组注射相等剂量的1%柠檬酸缓冲液。大鼠自由喂养，7 周后T1DM 组出现血糖明显升高，多饮、多食和消瘦等症状，而对照组大鼠血糖正常，体重增加。

1.3.2 空腹血糖、血清氧化应激指标及VEGF水平检测 大鼠空腹，断尾取血3 ～5 mL，罗氏血糖仪测定大鼠空腹血糖后，分离血清备测。T-AOC 采用Fe3+/Fe2+还原法;SOD 采用黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶法;GSH 采用二硫代二硝基苯甲酸(DTNB)比色法;MDA 采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法。血清VEGF 含量采用ABC-ELISA 双抗体夹心法。操作严格按照试剂盒说明书进行。

1.4 统计学分析 采用SPSS 11.5 软件进行统计分析。定量资料以均数±标准差表示，否则使用中位数(四分位数间距)表示。根据正态性与方差齐性，选择使用两独立样本均数t 检验或Satterthwaite t 检验比较;否则使用非参数Mann-Whitney U 检验。双变量关联性分析:服从正态分布的采用Pearson 积矩相关分析;否则使用Spearman 秩相关分析。以P≤0.05 为有统计学意义。

2 结 果

2.1 大鼠空腹血糖、氧化应激指标及VEGF 水平的检测 7 周后，T1DM 组大鼠空腹血糖值、血清MDA、VEGF 水平均高于对照组(P ＜0.05);而血清GSH、SOD 水平明显低于对照组(P ＜0.05)。组间T-AOC水平差异无统计学意义(P ＞0.05)。见表1。

表1 T1DM 模型大鼠空腹血糖、氧化应激指标及VEGF 水平的检测结果Table 1 Fasting blood glucose，oxidative stress indexes and VEGF in the type 1 diabetic rats

表1 T1DM 模型大鼠空腹血糖、氧化应激指标及VEGF 水平的检测结果Table 1 Fasting blood glucose，oxidative stress indexes and VEGF in the type 1 diabetic rats

指标 对照组(n=17) T1DM 组(n=23) t 值或U 值 P值空腹血糖(mmol/L)5.08±0.46 23.01±3.62 23.53 ＜0.001 T-AOC(U/mL) 4.26±2.12 3.38±2.51 1.17 0.249 GSH(g/L) 3.82±1.05 1.88(0.36) 8.00 ＜0.001 SOD(U/mL) 242.37±32.79 192.06±34.57 4.65 ＜0.001 MDA(nmol/mL) 4.42±0.37 4.94±0.63 3.27 0.002 VEGF(pg/mL)22.32±1.71 23.97±1.84 2.90 ＜0.006

2.2 空腹血糖与血清氧化应激指标及VEGF 水平间相关性分析 实验大鼠空腹血糖值与血清MDA、VEGF 水平之间呈正相关(r=0.51，r=0.47)，与血清GSH、SOD 水平呈负相关(r=-0.71，r=-0.40);与T-AOC 水平无相关。

2.3 VEGF 与血清氧化应激指标间相关性分析 实验大鼠血清VEGF 与血清MDA 水平成正相关(r=0.32)，与血清GSH 水平呈负相关(r=-0.34)，与T-AOC和SOD 水平无相关。

3 讨 论

氧化应激是指机体或细胞内的活性氧化物产生增多和抗氧化系统的清除能力降低，引起组织细胞损伤的一种病理状态，主要通过氧化修饰DNA 碱基、氨基酸及脂质过氧化反应等参与糖尿病的发生、发展［9］。糖尿病高血糖状态下机体产生的活性氧可引起细胞膜发生脂质过氧化反应，氧化修饰核酸碱基和(或)氨基酸，引起DNA 和(或)蛋白质损伤。还可诱导产生VEGF 等多种炎性因子及免疫分子，加重炎性反应［10-11］。产生的炎性因子(或免疫因子)反过来提高了β 细胞对自由基的敏感性，刺激炎性细胞及β细胞产生更多的自由基，形成恶性循环［12］。

近年来，不断有探讨糖尿病氧化应激机制的临床研究，其结果则不一致。Savu 等［3］发现糖尿病患者中，除MDA 含量增多外，SOD 含量也增多，而且在合并微血管和大血管病变患者中，这种现象尤为显著;王锦芝等［13］研究表明，糖尿病患者血清MDA水平升高，GSH、SOD 亦较对照组升高，T-AOC 水平则差异无统计学意义。但也有研究认为尤其合并并发症的糖尿病患者其抗氧化防御系统SOD、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶含量减低，而ROS 和MDA 含量增加，原因可能是临床研究人群受所选择病例所处病程时间、所接受的治疗方案及个体差异等方面的影响［4-5］。为进一步研究糖尿病氧化应激机制及血清VEGF 水平在糖尿病发生发展中的作用，本文采用注射STZ 的方法复制T1DM 大鼠模型。该模型具有操作简单、对组织毒性相对较小、造模后动物存活率高、稳定性好，且临床症状与人类糖尿病相似，已成为目前国内外常用的方法［7］。

本实验测定的氧化指标主要是MDA，其可通过多不饱和脂肪酸的过氧化或脂质过氧化的分解产物引起细胞损伤，测定其含量可反映出机体是否存在过氧化状态，同时也反映了细胞受损伤的程度［14］。反映机体抗氧化水平的指标主要有T-AOC、SOD 和GSH。T-AOC 能显示出机体的总抗氧化活性，其包含了各种抗氧化大分子、小分子和酶类抗氧化剂［15］。SOD 主要通过歧化作用清除氧自由基，维持机体的氧化与抗氧化平衡，保护细胞免受过氧化损伤。GSH 属非酶类抗氧化系统中的一种，其主要的活性状态是还原型谷胱甘肽，它能提高细胞的存活率，降低乳酸脱氢酶的释放，减轻脂质过氧化反应［16］。因此，测定SOD 活性及GSH 的含量可衡量机体抗氧化能力的大小。徐华等［17］研究显示，T1DM 大鼠血清MDA 含量显著升高，SOD 水平显著减少。随病程的延长，机体过氧化反应显著增强，抗氧化反应显著降低［18］。奚苗苗等［19］建立的T2DM大鼠模型也得出相应的结论。

我们的研究结果显示，T1DM 大鼠血清MDA 水平升高，血清SOD 与GSH 水平均显著降低，且空腹血糖与血清MDA 水平呈正相关，与血清GSH、SOD呈负相关，提示在糖尿病发生发展过程中，体内过氧化水平增高，抗氧化机制受损，且这种变化与糖尿病高血糖状态密切相关。实验结果还显示，虽SOD、GSH 水平降低，但T-AOC 无明显变化。一方面T-AOC作为反映总抗氧化能力的指标，未及时敏感地出现随SOD、GSH 降低的表现;另一方面，有研究表明［20］，糖尿病大鼠4 周时，体内的部分组织或细胞仍具有一定的代偿作用，血清T-AOC 可维持在正常水平，且未出现明显脂质过氧化反应增强。

VEGF 对单核/巨噬细胞具有化学催化作用，可促进血管内皮细胞分化、移行、增生和管腔形成，增强血管的通透性。缺血、缺氧和高糖化物终末产物可上调血清VEGF 水平［2］。本文实验结果显示，T1DM 大鼠血清VEGF 水平显著高于正常大鼠;空腹血糖与血清VEGF 水平之间呈正相关，且后者与血清MDA 的水平呈正相关，与血清GSH 水平呈负相关，再次提示高水平的VEGF 与糖尿病高血糖状态及过氧化程度增高有关。

综上所述，T1DM 发生发展中体内过氧化程度增强，抗氧化能力受损，这种变化与高血糖状态有关。

［1］ Stentz FB，Umpierrez GE，Cuervo R，et al.Proinflammatory cytokines，markers of cardiovascular risks，oxidative stress，and lipid peroxidation in patients with hyperglycemic crises［J］.Diabetes，2004，53(8):2079-2086.

［2］ 闫朝春.ET、VEGF、IL-6、TNF-α 在DM2 中作用机制的临床分析［J］.放射免疫学杂志，2010，23(2):148-150.

［3］ Savu O，Ionescu-Tirgoviste C，Atanasiu V，et al.Increase in total antioxidant capacity of plasma despite high levels of oxidative stress in uncomplicated type 2 diabetes mellitus［J］.J Int Med Res，2012，40(2):709-716.

［4］ Kasznicki J，Kosmalski M，Sliwinska A，et al.Evaluation of oxidative stress Markers in pathogenesis of diabetic neuropathy［J］.Mol Biol Rep，2012，39(9):8669-8678.

［5］ 赵国莉，吕肖锋，程千鹏.氧化应激与2 型糖尿病相关性的观察［J］.中国糖尿病杂志，2013，21(6):514-517.

［6］ 郑敬民，尹 广，恽时锋，等.糖尿病肾病患者尿液类胰蛋白酶水平检测及其病理意义分析［J］.医学研究生学报，2014，27(11):1176-1179.

［7］ 黄 琛，顾志峰，曹晓蕾，等.1 型糖尿病大鼠模型建立及稳定性研究［J］.现代检验医学杂志，2007，22(3):49-51.

［8］ 陈 枫，程锦楠，唐小平.大鼠品系药物剂量对糖尿病大鼠模型的影响［J］.泸州医学院学报，2011，2(34):156-158.

［9］ Lappas M，Mittion A，Permezel M.In response to oxidative stress，the expression of inflammatory cytokines and antioxidant enzymes are impaired in placenta，but not adipose tissue，of women with gestational diabetes［J］.Endocrinology，2010，204(1):75-84.

［10］ 肖园园，曾朝阳，田晓年，等.2 型糖尿病肾病患者血清脂联素、血管内皮生长因子水平与氧化应激的相关性［J］.武汉大学学报，2012，33(2):228-231.

［11］ 伏杭江，杜方翀，胡 燕，等.前列地尔治疗对2 型糖尿病肾病患者氧化应激损伤的影响［J］.医学研究生学报，2013，26(8):801-803.

［12］ 王柏荣，黄国良.氧化应激与胰岛β 细胞的关系［J］.医学综述，2007，13(12):913-915.

［13］ 王锦支，程姗姗，冯琳琳，等.52 例2 型糖尿病患者氧化应激状况分析［J］.重庆医学，2012，41(18):1850-1851.

［14］ 杨丽娟，游育红.细胞受到氧化应激后损伤的检测方法［J］.医学综述，2010，16(6):924-927.

［15］ 干 军，冯 雨，徐宽枫，等.血清氧化应激指标与早期糖尿病肾病及代谢综合症的关系［J］.临床荟萃，2007，22(14):998-1000.

［16］ 黄 珀，邓 勇，张春燕，等.外源性谷胱甘肽对肾小管细胞氧化应激的影响［J］.中国现代医学杂志，2004，14(20):139-143.

［17］ 徐 华，纳春祥，李海龙，等.糖尿病并发症相关性氧化应激的实验研究［J］.中国医药指南，2012，10(10):1-2.

［18］ 陈 枫，唐小平，唐 利，等.糖尿病大鼠内毒素和氧化应激水平变化对诱发肝纤维化的影响［J］.中国现代医学杂志，2012，22(22):5-9.

［19］ 奚苗苗，文爱东，梁 欣，等.2 型糖尿病大鼠模型的建立及其氧化应激特征分析［J］.中国药物与临床，2010，10(1):8-12.

［20］ 徐 波，雷少青.糖尿病鼠早期心脏抗氧化能力及心功能改变与脂质过氧化反应的关系［J］.武汉大学学报，2010，31(1):16-19.