体外醛固酮对大鼠系膜细胞凋亡基因的影响

施会敏，张 俊，何燕芳，张爱青，甘卫华

0 引 言

系膜细胞是肾小球固有细胞的重要组成成分，正常情况下，其数量、形态和位置均保持相对稳定，对维持肾正常的结构和功能发挥着重要作用。但在许多慢性肾病(chronic kidney disease，CKD)中常伴有肾小球系膜细胞的损伤，系膜细胞凋亡是多种肾疾病的共同组织病理学改变，研究表明，系膜细胞凋亡可导致大鼠蛋白尿的发生，凋亡程度与其严重程度密切相关［1］。近年研究表明肾素-血管紧张素-醛固酮系统(renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS)在CKD 发病机制中发挥着重要的作用。醛固酮作为RAAS 系统的主要效应分子，除了其血流动力学效应致水钠潴留以外，其余多种途径亦可导致肾小球硬化、肾间质纤维化，并可造成肾小球系膜细胞及足细胞的损害［2-5］，导致蛋白尿，介导CKD 的进展及恶化，但其致肾损伤的具体机制目前尚不明确。因此，本研究拟探讨醛固酮是否可通过调控凋亡相关基因P53、Bcl-2 和C-myc 从而引起大鼠系膜细胞凋亡，旨在为临床应用醛固酮受体拮抗剂治疗相关肾病提供一定的实验基础和理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料和仪器 正常大鼠肾小球系膜细胞株(中国典型培养物保藏中心;胎牛血清(Gibco，美国);0.25%含EDTA 的胰蛋白酶(Gibco，美国);DMEM 培养液(Gibco，美国);醛固酮(Sigma，美国);Trizol(Invitrogen，美国);总RNA 提取试剂盒(TIANGEN，德国);逆转录试剂盒(Thermo，加拿大);SYBR PCR Mix(Life，美国);倒置显微镜(Olympus，日本);流式细胞仪(BD，法国);PCR 仪(Life，美国)。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 大鼠肾小球系膜细胞生长于含10%胎牛血清的DMEM 培养液(含青霉素100 U/mL，链霉素100 μg/mL)中，置于37 ℃、5%CO2培养箱内培养，每2 天换液，当细胞长至70%～80%融合时用0.25%的胰酶消化传代，取第4 ～6 代细胞用于实验。

1.2.2 细胞毒性试验检测 将处于对数生长期的系膜细胞用胰酶消化后，以2×105个/孔密度接种于6 孔板培养。本研究以10-7、10-6、10-5、10-4、10-3mol/L 醛固酮分别作用系膜细胞24 h 后，弃上清，用胰蛋白酶洗脱细胞，取0.1 mL 所得细胞悬液，加入0.1 mL 0.3%锥虫蓝及0.8 mL D-Hanks 液混合均匀，计算活细胞比率。相差显微镜下，死亡细胞着色，活细胞透明状。公式如下:

活细胞比率=［活细胞数/(活细胞数+死细胞数)］×100%

根据公式得出10-7、10-6、10-5mol/L 醛固酮作用系膜细胞活力均在90%以上，提示这3 种浓度无明显毒性作用，本研究选用10-6mol/L 醛固酮进行实验。

1.2.3 Annexin V/PI 双染流式细胞术检测细胞凋亡根据Annexin V-FITC/PI 凋亡检测试剂盒说明操作。将处于对数生长期的细胞用胰酶消化后，以2×105个/孔密度接种于6 孔板培养，当细胞长至70%～80%融合时换用无血清培养液继续培养24 h，使细胞生长同步化。实验分组如下:对照组;醛固酮组:培养液+醛固酮(10-6mol/L)。24 h 后胰酶消化后收集细胞，用预冷的PBS 洗涤细胞2 次并离心，100 μL 预冷binding buffer 重悬细胞，加入5 μL Annexin v-FITC 和5 μL PI 混匀，避光室温反应10 min，加人400 μL binding buffer 终止反应，筛网过滤后用流式细胞仪检测细胞凋亡率。BD Accuri C6软件分析细胞凋亡。

1.2.4 RT-PCR 检测P53、Bcl-2、C-myc mRNA 的表达细胞生长同步化后，根据不同分组处理细胞。24 h 后收集细胞，每组均设6 个重复。用Trizol 按TIANGEN 总RNA 提取试剂盒说明书操作。用核酸分析仪测定所提取RNA 的浓度和纯度。取1 μg 总RNA 配制逆转录反应体系，按试剂盒说明合成cDNA，反应条件:25 ℃5 min，45 ℃60 min，70 ℃5 min。以此为模板用P53、Bcl-2、C-myc 和GAPDH 引物经荧光定量PCR方法进行扩增。引物使用Premier 3.0 软件辅助自行设计，所有引物由Invitrogen公司上海合成部合成，引物序列如下:大鼠GAPDH sense:5'-CAAGTTCAACGGCACAGTCAA-3'，GAPDH antisense:5'-TGGTGAAGACGCCAGTAGACTC-3'(149 bp);大鼠P53 sence:5'-TCTCCCCAGCAAAAGAAAAA-3'，P53 antisense:5'-CTTCGGGTAGCTGGAGTGAG-3'(168 bp);大鼠Bcl-2 sense:5'-CGACTTTGCAGAGATGTCCA-3'，Bcl-2 antisense:5'-CGACTTTGCAGAGATGTCCA-3'(223 bp);大鼠C-myc sense:5'-CGAGCTGAAGCGTAGCTTTT-3'，C-myc antisense:5'-CTCGCCGTTTCCTCAGTAAG-3'(170 bp)。PCR反应条件为:预变性95 ℃10 min，变性95 ℃15 s，退火56 ℃20 s，延伸72 ℃1 min，共40 个循环。每组重复3 次。PCR 结果分析:以GAPDH 作为内参，应用2-ΔΔCt法，计算目的基因的相对表达量。

1.3 统计学分析 应用SPSS 20.0 软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差()表示，组间均数比较采用独立样本t 检验。组间方差不齐时采用Satterthwaite 校正t 检验。以P≤0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 醛固酮对大鼠系膜细胞形态的影响 倒置显微镜下观察，对照组系膜细胞形状不规则，胞体可呈长梭形、星形、纺锤形或树枝状，细胞核呈圆形或卵圆形，位于细胞中央，细胞质多向外伸出树枝状突起，长短不一。细胞密度较大时，系膜细胞可叠加生长，形成相互交错的网络。醛固酮组系膜细胞形态无明显变化。见图1。

图1 倒置显微镜下观察系膜细胞形态(×100)Figure 1 Effects of aldosterone on mesangial cell morphology(×100)

2.2 醛固酮对大鼠系膜细胞凋亡的影响 流式细胞仪检测细胞凋亡结果显示醛固酮组系膜细胞凋亡率较对照组显著升高［(32.87±4.98)%vs(68.62±1.77)%，P ＜0.05］。见图2。

2.3 醛固酮对凋亡相关基因P53、Bcl-2、C-myc mRNA 表达的影响 RT-PCR 结果显示，醛固酮组P53 基因相对表达量较对照组明显上升(2.82±0.35 vs 1.00±0.09，P ＜0.05)、Bcl-2 基因相对表达量较对照组明显下降(0.11±0.01 vs 1.00±0.24，P ＜0.05)、C-myc 基因相对表达量较对照组显著上升(1.85±0.35 vs 1.00±0.12，P ＜0.05)。

图2 醛固酮对大鼠系膜细胞凋亡的影响Figure 2 Effects of aldosterone on mesangial cell apoptosis

3 讨 论

CKD 进展恶化将导致慢性肾衰竭，是危害人类健康的主要疾病之一。作为肾疾病研究领域的热点，长久以来人们一直在探讨影响CKD 进展的因素并试图寻找延缓或阻止其发生发展的新策略。已有的动物实验及临床研究结果显示，RAAS 激活是引起CKD 发生发展的一个重要的机制［6-7］，且越来越多的证据提示醛固酮可能作为一个独立的危险因素直接参与肾损害［8］，是CKD 进展的一个关键递质。但是人们对于醛固酮与肾损害关系的认识只是初步的，其确切机制并未完全明了。

细胞凋亡即细胞程序性死亡，是指细胞在一定的生理或病理条件下、由一系列酶参与、基因调控的一个主动死亡过程。细胞凋亡对于胚胎发育及维持细胞内环境稳定具有重要意义。慢性肾疾病的发生发展的过程中，细胞凋亡扮演了非常重要的角色［9-11］。可表现为系膜细胞、内皮细胞、足细胞等的凋亡［12］，干预肾疾病细胞的凋亡及调控基因，可能会阻止肾疾病的进展［13］。本研究结果显示与对照组相比，醛固酮组系膜细胞凋亡率明显升高，且醛固酮组P53 基因、C-myc 基因表达明显升高，Bcl-2基因表达明显下降，提示醛固酮可能通过上调P53基因及C-myc 基因的表达，并下调Bcl-2 基因的表达引起系膜细胞凋亡，其机制可能与凋亡基因的独立作用及相互间的协同作用有关。环孢素作为治疗肾疾病的常见药物，其显著的不良反应也备受关注，引起系膜细胞的凋亡是否参与其中，仍不明确。Han等［14］报道环孢素也可通过上调P53 基因并下调Bcl-2 基因的表达诱导系膜细胞凋亡。另有研究表明糖尿病肾病伴随的系膜细胞凋亡可能是促进肾衰竭的重要因素［15］，可见系膜细胞损伤在CKD 的疾病进展过程中发挥着重要作用。醛固酮除可诱导系膜细胞凋亡外，Chen 等［2］研究发现，醛固酮也可诱导足细胞凋亡，多种损伤因素共同作用，共同促进疾病的进展及恶化。同时已有研究表明，醛固酮受体拮抗剂可对抗醛固酮引起的系膜细胞凋亡［3，16］，但是其对肾损伤的影响仍不清楚。本文结果提示，醛固酮可能通过上调P53 基因及C-myc 基因的表达，并下调Bcl-2 基因的表达诱导系膜细胞凋亡，推测系膜细胞凋亡增加可能是醛固酮引起的肾损伤的机制之一。因此本研究结果可以为醛固酮在肾损害的作用机制研究中提供一定的实验基础和理论依据。

［1］ Abboud HE.Mesangial cell biology［J］.Exp Cell Res，2012，318(9):979-985.

［2］ Chen C，Liang W，Jia J，et al.Aldosterone induces apoptosis in rat podocytes:role of PI3-K/Akt and p38MAPK signaling pathways［J］.Nephron Exp Nephrol，2009，113(1):e26-e34.

［3］ Mathew JT，Patni H，Chaudhary AN，et al.Aldosterone induces mesangial cell apoptosis both in vivo and in vitro［J］.Am J Physiol Renal Physiol，2008，295(1):F73-F81.

［4］ Nagase M，Fujita T.Endocrinological aspects of proteinuria and podocytopathy in diabetes:role of the aldosterone/mineralocorticoid receptor system［J］.Curr Diabetes Rev，2011，7(1):8-16.

［5］ 江罗佳，房向东，涂卫平.活性维生素D 及其类似物对足细胞保护的作用机制［J］.医学研究生学报，2014，27(8):888-892.

［6］ Mackenzie HS，Ziai F，Omer SA，et al.Angiotensin receptor blockers in chronic renal disease:the promise of a bright clinical future［J］.J Am Soc Nephrol，1999，10(Suppl 12):S283-S286.

［7］ Kolesnyk I，Struijk DG，Dekker FW，et al.Effects of angiotensin-converting enzyme inhibitors and angiotensin II receptor blockers in patients with chronic kidney disease［J］.Neth J Med，2010，68(1):15-23.

［8］ Bolignano D，Palmer SC，Navaneethan SD，et al.Aldosterone antagonists for preventing the progression of chronic kidney disease［J］.Cochrane Database Syst Rev，2014，4(6):CD007004.

［9］ Qiu W，Zhou J，Zhu G，et al.Sublytic C5b-9 triggers glomerular mesangial cell apoptosis via XAF1 gene activation mediated by p300-dependent IRF-1 acetylation［J］.Cell Death Dis，2014，5(4):e1176.

［10］ Chen KC，Peng CC，Hsieh CL，et al.Exercise ameliorates renal cell apoptosis in chronic kidney disease by intervening in the intrinsic and the extrinsic apoptotic pathways in a rat model［J］.Evid Based Complement Alternat Med，2013，2013:368450.

［11］ 陈 瑜，刘翠萍，茅晓东，等.糖基化终产物诱导小鼠足细胞内质网应激和细胞凋亡的研究［J］.医学研究生学报，2013，26(11):1129-1133.

［12］ Li X，Pabla N，Wei Q，et al.PKC-delta promotes renal tubular cell apoptosis associated with proteinuria［J］.J Am Soc Nephrol，2010，21(7):1115-1124.

［13］ Hughes J，Cailhier JF，Watson S，et al.Apoptosis in glomerulonephritis［J］.Curr Dir Autoimmun，2004，30(3):655-676.

［14］ Han SY，Chang EJ，Choi HJ，et al.Apoptosis by cyclosporine in mesangial cells［J］.Transplant Proc，2006，38(7):2244-2246.

［15］ Sanchez-Niño MD，Benito-Martin A，ortiz A.New paradigms in cell death in human diabetic nephropathy［J］.Kidney Int，2010，78(8):737-744.

［16］ Zhu D，Yu H，He H，et al.Spironolactone inhibits apoptosis in rat mesangial cells under hyperglycaemic conditions via the Wnt signalling pathway［J］.Mol Cell Biochem，2013，380(1/2):185-193.