念珠菌与黑色素的相关性研究

邓 琳，黄苏扬，孔庆涛，李宗辉，桑 红

0 引 言

念珠菌是常见的机会性致病真菌之一，是人体的共生菌群，正常情况下可寄生于体表、口腔、泌尿生殖道、胃肠道等部位，在免疫缺陷的患者中，念珠菌可以引起从皮肤黏膜到威胁生命的播散性感染。其中白念珠菌是器官移植患者侵袭性真菌感染的首要原因［1］。目前，念珠菌感染致病因子有表型转换、粘附性、侵袭性酶的分泌、生物被膜的形成等。近年的研究发现念珠菌可以产生黑色素，推测黑色素可能与念珠菌致病性相关［2］，但其具体机制和相关因素尚不明确。

黑色素是一类在动植物和微生物普遍存在的深褐色至黑色为主的色素，依据其合成底物和中间产物的不同而分为不同的种类。黑色素具有抗氧化、抗溶菌酶、吸收紫外线、抵御宿主免疫攻击等生物学功能［3］。黑色素与许多真菌的致病毒力有关，如新生隐球菌、着色芽生菌、马拉色菌等;黑色素在真菌侵入宿主和抵御环境的不良影响方面具有重要作用［4］。本研究通过搜集不同部位不同种临床念珠菌菌株，在3种产黑培养基上进行筛选，并通过观察超微结构变化进一步研究念珠菌和黑色素之间的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 白念珠菌标准株1 株，SC5314;新生隐球菌标准株1 株，BLS71 血清型A，由卫生部医学微生物菌(毒)种保藏管理中心真菌中心(中国医学科学院皮肤病研究所)提供。临床分离念珠菌株360 株，标本均来自本院。标本来源包括口腔、阴道、尿等部位。

1.1.2 主要试剂及仪器 葡萄糖、蛋白胨、琼脂粉、MgSO4、KH2PO4、L-DOPA、天冬氨酸、甘氨酸、咖啡酸、米粉、吐温80、科马嘉显色培养基、蒸馏水、恒温培养箱(上海柏欣仪器设备厂)、细胞计数板(美国corning incorporated)、透射电子显微镜(TEM，日本电子JEM-2100)、电子自旋共振波谱仪(ESR，德国Magnettech，MiniScope MS300)。

1.2 方法

1.2.1 培养基制备 用葡萄糖20.0 g，蛋白胨10.0 g，琼脂15.0 g，蒸馏水1000 mL;将琼脂加入蒸馏水中，加热溶解，再加入其他成分溶解后调整pH值至5.5 ～6.0，高压灭菌，121 ℃，15 min，冷却后倒无菌平皿，置4 ℃制成沙氏培养基。依照参考文献［5］制备保存多巴培养基和咖啡酸培养基。依照参照文献［6］制备保存添加多巴的基本培养基。

1.2.2 培养 所有菌株接种沙氏培养基上30 ℃培养24 ～48 h，挑取菌落转种科玛嘉显色培养基进行鉴定，检出360 株念珠菌株构成。

1.2.3 接种 所有菌株经活化后，以无菌蒸馏水制成2×106cfu/mL 菌悬液，用移液枪取30 μL 菌悬液接种于已凝固的多巴培养基、咖啡酸培养基和基本培养基上，每个菌株每种培养基接种3 份，置入35 ℃恒温培养箱中培养。实验重复3 次。

1.2.4 观察方法 多巴培养基、咖啡酸培养基和基本培养基于接种第3、5、7、10 天观察颜色变化并拍照。

1.2.5 透射电子显微镜 对多巴培养基上产黑的新生隐球菌、白念珠菌SC5314 和菌落疑似变黑的念珠菌，用无菌蒸馏水冲洗、离心收集后2.5%戊二醛在4 ℃下固定24 h 按照文献［7］处理后，在透射电镜下观察拍照。

1.2.6 电子自旋共振波谱仪 用电子自旋共振波谱仪对变黑最明显的SC5314 进行检测。将冷冻干燥的0.3 g 黑色素样品加入波谱仪管中，擦净管外壁，置于谐振腔中。波谱仪工作参数如下，磁场:中心磁场3509.8 G，扫场宽度200 G;微波辐射:微波频数9.5 ～10.0 GHz，功率0.4 ～1.0 mW;信号通道:时间常数40.960 ms，扫描时间41.943 s;信号接收:调制频数100 kHz，调制振幅0.2 ～1.0 mT，增益103～105;温度:室温［8］。

2 结 果

2.1 念珠菌的菌株分布和不同来源变黑情况 多巴培养基:临床念珠菌12 株变黑(阴道4 株、口腔3株、尿液3 株、血液1 株、趾甲1 株)，均为白念珠菌;基本培养基:15 株变黑(阴道5 株、尿液5 株、口腔4 株、血液1 株)，均为白念珠菌。上述12 株和15株临床念珠菌无重复，且部位之间重叠。见表1。

表1 360 株念珠菌菌株及不同部位变黑情况比较［n(%)］Table 1 Pigmentation of the 360 strains of clinically isolated Candidas n(%)

2.2 产黑素的结果 第3 天时，新生隐球菌在3 种产黑培养基上开始变为棕褐色;第5 天时，白念珠菌SC5314 在多巴和添加多巴的基本培养基上变为棕褐色，第7 天开始黑色，其余临床念珠菌仍未显色，见图1。第10 天时，360 株念珠菌中12 株在多巴培养基上变为棕褐色;15 株在基本培养基上变棕褐色，见图2;除新生隐球菌变为棕褐色外，SC5314 和临床念珠菌在咖啡酸培养基上均未变色。

图1 新生隐球菌、SC5314 和其余临床念珠菌在3 种培养基培养上的菌落图Figure 1 Cryptococcus neoformans，SC5314，and clinically isolated Candidas in the three types of culture media

图2 培养10 d 的临床念珠菌菌落Figure 2 Clinically isolated Candidas at 10 days in DOPA agar and minimal medium

2.3 透射电子显微镜结果 在透射电子显微镜下，产黑的新生隐球菌可见细胞壁的外层有一高电子密度层，而SC5314 和变色的临床念珠菌中未出现相似的结构，见图3。

2.4 电子自旋共振波谱结果 参照文献［7］已报道阳性对照新生隐球菌能检测到信号，而本研究中产黑最明显的SC5314，未检测到波普信号，见图4。

图3 新生隐球菌、SC5314 和临床念珠菌的透射电镜图Figure 3 Cryptococcus neoformans，SC5314，and clinically isolated Candidas under the transmission electron microscope

图4 新生隐球菌和SC5314 的电子自旋共振波谱Figure 4 Cryptococcus neoformans and SC5314 under the electron spin resonance spectroscope

3 讨 论

念珠菌属是引发人类侵袭性真菌感染的最常见的病原菌。念珠菌感染中主要由白念珠菌所致，约占50%～70%［9］。然而最近10 余年临床分离的念珠菌属中非白念珠菌呈增多趋势［10］;本研究搜集的360 株念珠菌，其中白念珠菌占48.6%，非白念珠菌占51.4%，非白念珠菌比例高于白念珠菌，与文献报道一致［10］。本研究360 株念珠菌中以口腔最多，阴道和尿液次之。可见念珠菌容易侵袭呼吸道、泌尿系统，可能由于患呼吸道泌尿系统疾病患者居多或抗生素不合理应用，抵抗能力低下所致，有关具体原因尚待进一步研究。

黑色素能抵抗日光和紫外线的辐射损伤，具有抗电离辐射作用［11－12］。黑色素与多种病原真菌的致病性紧密相关，例如构巢曲霉、烟曲霉［13－14］、新生隐球菌、念珠菌［15］。

Morris-Jones 等［2］首先证实白念珠菌在体外和体内均可合成黑色素，其黑色素与其他病原真菌产生的黑色素具有相同的抗原性，推测其与白念珠菌致病性相关，但其研究未对黑色素进行波谱检测。国内关于念珠菌与黑色素的关系尚未研究。本研究360 株念珠菌中，多巴培养基上12 株和基本培养基上15 株变为棕褐色，两者之间菌株无重复，且均为白念珠菌。其中第5 天时，SC5314 在多巴培养基和添加多巴的基本培养基上开始变棕褐色，第7 天时变黑色，取SC5134 变黑最明显时和变黑的临床念珠菌做透射电镜，结果显示在透射电镜下未在细胞壁外见到黑色素颗粒。

2010 年，Walker 等［16］观察到白念珠菌SC5314在含多巴的培养基上经4 ～8 d 产生黑色素，在透射电镜下可见白念珠菌SC5314 细胞壁外存在黑色素颗粒。但其推测黑色素可能只是一种代谢产物，白念珠菌在细胞内形成黑素小体，穿过细胞壁在细胞外释放黑色素。本实验结果念珠菌变黑的原因可能与多巴见光氧化分解有关，并非黑色素;此外根据Walker 的推测也有可能是SC5314 在细胞内形成黑素小体，释放到细胞外后未结合到细胞壁上，故在透射电镜下未看到黑色素颗粒。关于其变黑的具体机制还有待进一步研究。

Walker 等［16］的实验中SC5314 是在液体基本培养基中，置入200 转摇床37 度下培养，由于旋转过程中液体培养基不稳定，故其电镜表面的黑色素颗粒可能在旋转的过程中粘附在细胞壁的表面。而本研究中，使用的培养基均为固体培养基，置入35 度恒温培养箱中避光培养。使用固体培养基在静态下培养，比在液体培养基旋转条件下培养更稳定，更能反应真菌生长真实情况。

此外，黑色素是一种带负电荷稳定的有机自由基，不溶于水和有机溶剂，对浓酸抵抗，对氧化剂敏感，具有电子自旋共振特性［17］。有研究者已用ESR 波谱法证明电子从溶液中的自由基转移到新生隐球菌黑素［18］。本研究对变黑最为明显的SC5314 检测波谱，结果显示未检测到其信号。

本研究分离360 株念珠菌进行研究，样本量少，还需要继续加大样本进行筛选。同时，还可进一步用酶联免疫吸附实验来验证黑色素，用抗黑色素单克隆抗体标记变色的念珠菌，加入荧光素异硫氰酸盐免疫球蛋白IgM，在荧光显微镜下观察是否有黑色素颗粒存在［19］。

黑色素被认为是许多病原真菌的毒力因子，在病原真菌的致病过程中担任着重要角色。念珠菌与黑色素的关系，以及其合成机制、是否存在类似编码漆酶的基因及其在致病机制中的作用还需进一步研究。

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