3种结核杆菌检测方法在结核病诊断中的应用研究

王志佳，石少敏，李 丹

3种结核杆菌检测方法在结核病诊断中的应用研究

王志佳1a，石少敏1b＊，李 丹2

（1.吉林大学中日联谊医院a放射线科；b呼吸内科，吉林长春130033；2.吉林省人民医院感染科）

结核病（TB）是一类由结核分枝杆菌引起的慢性肉芽肿性的炎症，结核分枝杆菌可感染全身多个系统，其中最常见的是肺结核。据统计，当前全球已有1／3的人口为结核病患者［1］，每年约800万－1000万名患者最终发展成活动性结核病患者，每年约200－300万人死于肺结核［2］。近年来，由于耐多药结核病（MDR－TB）的流行与传播、HIV患者的感染，以及全球人口流动等问题的出现，使结核病疫情日趋严峻，已成为严重的社会及公共卫生问题，TB的预防和控制显得尤为重要。

1 资料与方法

1.1 研究对象

2013年7月至2014年3月收集175例本院（吉林大学中日联谊医院）呼吸内科就诊的疑似活动性结核病人，收集病例完成后对所有病例进行初步的评估，依据评估可以分为二组：活动性结核病患者组、非活动性结核病患者组（临床的表现可以排除结核）。活动性结核病病人组又进一步分为确诊组和临床诊断组，如果实验室结核杆菌培养为阳性的或者有明确的病理学诊断依据的归入确诊组；临床表现疑似结核病患者，通过抗结核治疗有一定的效果的患者归位临床诊断组。

1.2 研究方法

标本为研究对象的痰液、胸腔积液或支气管镜肺泡灌洗液。

（1）结核杆菌检测试剂盒（胶体金法）试验 通过定性检测结核菌的分泌性蛋白质，当有两条线同时出现时可判断为阳性，只有一条对照线出现时则判断为阴性，其反应时间15分钟，即可判读结果。

（2）TST实验 使用孟都氏法在检测者左前臂的内侧皮下注射PPD（0.lml同时含BCG－PPD 5IU），测试者局部形成了明显的皮丘。注射后48－72小时后测量在皮肤上形成的硬结的直径大小，横径和纵径平均值为硬结平均直径（d）d＜5mm定义为阴性病例（－）；d介于5mm到9mm之间定义为弱阳性病例（＋）；d介于10mm到19mm之间定义为阳性病例（＋＋）；d＞20mm出现破渍、水泡、双圈强阳性定义为强阳性病例（＋＋＋）

（3）结核杆菌DNA PCR检测 取测试者痰液标本，5%氢氧化钠处理两小时后置于EP管中离心10分钟（13000转）后去除离心后的上清，于沉淀物中加入生理盐水，继续离心10分钟（同转速）。去除离心后的上清，于沉淀中加入TB溶液（30μl），混匀后水浴，首先100℃水浴30分钟，然后37℃水浴10分钟，继续离心10分钟（同转速），取离心后上清加入反应液中，进行PCR检测。

1.3 统计学处理

统计学处理釆用SPSS13.0统计软件对结果进行统计分析，其中计数资料采用χ2检验方法进行分析，P≤0.05定义为有统计学差异。

2 结果

最终诊断为结核病46例（26.2%），男女比例3∶1，中位年龄40.2岁。确诊组46例中，病理确诊1例；结核杆菌培养阳性41例，余4例诊断为临床诊断结核病，为试验性抗结核治疗有效，且均为结核性胸膜炎；非活动性结核病的患者共110例，男女比例为3∶1，中位年龄46岁，其中肺部感染55例、间质性肺病11例、脓胸2例、消化系统感染3例、血液系统疾病3例、恶性肿瘤15例、风湿免疫系统疾病11例、心功能不全6例、AIDS 4例。

2.1 比较胶体金法、PCR、TST三种不同的方法诊断活动性结核患者敏感度

在最终诊断为结核病的46例患者中，34例胶体金法检测阳性，12例阴性，本研究将胶体金法检测结果为（＋）、（＋／－）均统一定性为阳性，该方法对于诊断活动性结核病的敏感度为73.9%。本研究将结核菌素实验TST应用检测患者的皮肤硬结直径大小，如果直径大于10mm均定义为阳性，其中31例患者利用TST法检测呈现阳性，15例被检测为阴性，TST法检测对于诊断活动性结核病的敏感度为67.4%。PCR检测的46例患者中，21例被定义为阳性，25例被定义为阴性，此方法的诊断敏感度为45.7%。胶体金法与TST敏感度比较无明显差异（P＞0.05），胶体金法与PCR敏感度比较有明显差异（P＜0.01）（见表1）。

46例活动性结核病患者，其中16例患者胶体金法测阳性，14例TST检测阳性，9例PCR检测阳性，三种检测结核性胸膜炎的敏感度分别为72.7%、63.6%、40.9%。胶体金法与TST敏感度比较无明显差异（P＞0.05）。胶体金法与PCR敏感度比较有明显差异（P＜0.05）。

2.2 比较胶体金法、TST、PCR在诊断活动性结核病中的特异度

通过临床特征和检测排除活动性肺结核的110例患者中，利用胶体金法检测结果显示有89例结果为阴性，检测的特异度高达80.9%，52例患者TST检测为阴性，其特异度为47.3%，95例患者行PCR检测阴性，其特异度为86.4%，胶体金法与TST特异度比较有显著差异（P＜0.001），前者明显大于后者；胶体金法与PCR特异度比较无差异（P＞0.05），二者特异度均较高（见表1）。

110例非活动性结核病患者28例行抗原胶体金法检测23例阴性，行TST检测13例阴性，行PCR检测24例阴性，三种检测结核性胸膜炎的特异度分别为82.1%、46.4%、85.7%。胶体金法与TST特异度比较有明显差异（P＜0.05），胶体金法与PCR特异度比较无明显差异（P＞0.05）。

2.3 比较胶体金法、TST、PCR检测疾病的符合率

胶体金法、TST方法以及PCR方法对结核病患者和非结核病患者进行检测，检测的符合率分别为78.8%、53.2%、74.4%。胶体金法、TST、PCR鉴别结核性胸膜炎与非结核性胸膜炎的符合率分别为78.0%、54.0%、66.0%。胶体金法与TST比较有统计学意义，（P＜0.01），胶体金法与PCR比较无统计学差异（P＞0.05）（见表1）。

表1 三种检测方法敏感度、特异度、符合率的比较

3 讨论

目前在我国，仅活动性肺结核病人约450万，且正逐渐增多。近年来由于各种原因，使得耐药结核病人，尤其是MDR－TB病人不断增加，而临床上用于MDR－TB的有效抗痨药物疗效有限，使国民生活质量受到严重影响，结核病亦受到全球的重视。

1999年，研究者利用基因芯片技术对H37Rv（结核杆菌标准株）和BCG基因组进行了检测比较，发现了在BCG中缺失的而仅存在于结核杆菌中的129个开放读码框，这些开放读码框可以划分为16个区域（RD1－RD16），统称为RD区片段［3］。RD区编码的蛋白包括ESAT－6、CFP－10、MPT64、38 kDa、30kDa、Rv3871、Rv3872、Rv3873等，其中ESAT－6、CFP－10是MTB生长早期分泌的特异性蛋白［4］，MTP64是一种特异性的蛋白质［5］，其属于MTB的一种代谢产物，检测MTP64蛋白质的水平可以反映MTB总体的生长情况，近年来应用重组技术及杂交技术可制备一些单克隆抗体，像ESAT－6、CFP－10、MPT64，这些单克隆抗体可以被应用于MTB的病原的科研中同时对结核病的诊断也有一定的意义［6］。结核菌检测试剂盒（胶体金法）是一种采用上述单克隆抗体作为胶体金标记抗体来检测结核菌分泌的特异性抗原的检测工具，此方法可快速简便地检测各种液体标本中的特异性抗原。提高检测的特异性和灵敏度可以通过采用多种抗原联合检测的手段。

实验结果显示，胶体金法与TST检出结核菌的能力相似而高于PCR法。在结核性胸膜炎中亦存在同样的结果。本研究中46例活动性结核病患者出现了12例阴性，其中3例口服莫西沙星片，5例静脉注射莫西沙星，Johnson JL［7］的实验认为莫西沙星（MXFX）可于感染初期有效杀菌作用，杀菌作用略低于抗结核药物异烟肼（INH），MXFX能很好的渗入结核病变中，能快速杀灭空洞性肺结核病人痰中部分结核杆菌，这可能是该12例患者检测阴性的原因。另有4例患者留取的血性或脓性痰标本培养阳性而胶体金法检测为阴性，可能是因为该标本所含的其他成分对结核菌分泌蛋白的萃取和释放产生干扰，无法得出可靠结果，或者痰标本存在的不均一性致使取样差异引起。

本研究中TST特异度与Pai M［8］等的研究中所得结果相符，在非活动性结核病组中，胶体金法与TST特异度比较P＜0.05，有明显统计学差异；胶体金法与PCR特异度比较P＞0.05，无统计学差异。在非结核性胸膜炎的胸水中胶体金法与TST特异度比较有显著差异，说明胶体金法在排除非活动性结核病的能力明显优于TST；胶体金法与PCR特异度比较无明显差异，提示胶体金法与PCR在排除非活动性结核性疾病的能力相似，且两种方法在两组中特异度均较高。

本试验发现PCR技术虽然具有较高敏感度及特异度，但仍不可避免出现假阳性反应，因此PCR技术还存在稳定性不高的因素，这些可能有多方面的因素引起，例如操作的失误，标本本身的因素等［9］。

似然比不受患病率的影响，并且检测的稳定性很高，可以通过其判断实验诊断结果显示出的阳阴性是患者患病的大致概率。本研究发现，在诊断活动性结核病与非活动性结核病中胶体金法的阳性预测值明显高于其他两种检测方法，有统计学意义，阴性预测值无统计学意义，本研究中，胶体金检测的PLR为3.87，为三种方法中最高的，NLR为0.32为三种方法中最低的，在结核性胸膜炎的检出中亦得到了同样的趋势。

综上所述，胶体金法具有结果可靠，操作简单、快速，不需进行镜下观察；适用于一般人群普查快速检测。胶体金法检测活动性结核病的敏感度较高，且检测能力较TST强，但是也存在着预测值不是很高的不利因素，因此其对结核病的诊断还需要结合患者的临床表现。

［1］张培元.肺结核诊断和治疗指南［J］.中华结核和呼吸杂志，2001，24（2）：70.

［2］梁 爽.我国结核病的流行情况与控制对策［J］.中国煤炭工业医学杂志，2009，12（1）：128.

［3］Behr MA，Wilson MA，Gill WP，et al.Comparative genomics of BCG vaccines by whole－genome DNA microarray［I］.Science，1999，284（5419）：1520.

［4］Berthet FX，Rasmussen PB，Rosenkrands I，et al.A Mycobacterium tuberculosis operon（CFP－10）［J］.Microbiology，1998，144（Pt 11）：3195.

［5］Abe C，Hirano K，Tomiyama T.Simple and rapid identification of the Mycobacterium tuberulosis complex by immunochromatographic assay using anti－MPB64monoclonal antibodies［J］.J Clin Microbiol，1999，37（11）：3693.

［6］吴雪琼，张俊仙，李洪敏，等.结核分枝杆菌MPT64蛋白的表达、纯化及初步应用［J］.中国防痨杂志，2011，23（2）：85.

［7］Johnson J L，Hadad D J，Boom W H，et al.Early and extended early bactericidal activity of levofloxacin，gatifloxacin and moxifloxacin in pulmonary tuberculosis［J］.The International Journal of Tuberculosis and Lung Disease，2006，10（6）：605.

［8］Pai M，Zwerling A，Menzies D.Systematic review：T－cell－based assays for thediagnosis of latent tuberculosis infection：an update［J］.Ann Intern Med，2008Aug5，149（3）：177.

［9］Mustafa AS.Mycobacterial gene cloning and expression，comparative genomics，bioinformatics and proteomics in relation to the development of new vaccines and diagnostic reagents［J］.Med Princ Pract，2005，14（Suppl 1）：27.

石少敏（1981－），主治医师，讲师，主要从事呼吸系统疾病研究。

2014－10－15）

1007－4287（2015）10－1788－03

＊通讯作者