先天性心脏病与血管内皮生长因子－634G＞C的相关性研究

杨明远，徐 光，王玉妍

（1.长春市儿童医院心胸外科，吉林长春130051；2.吉林大学第一医院感染科；3.吉林大学中日联谊医院）

先天性心脏病与血管内皮生长因子－634G＞C的相关性研究

杨明远1，徐 光2，王玉妍3＊

（1.长春市儿童医院心胸外科，吉林长春130051；2.吉林大学第一医院感染科；3.吉林大学中日联谊医院）

先天性心脏病（congenital heart disease，CHD）是先天性畸形中最常见的一类，约占各种先天畸形的28%，它是指在胚胎发育时期由于心脏及大血管的形成障碍或发育异常而引起的解剖结构异常，或出生后应自动关闭的通道未能闭合（在胎儿属正常）的情形。先天性心脏病发病原因很多，以遗传因素和环境因素为主。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是血管内皮细胞特异性的肝素结合生长因子，可在体内诱导血管新生［1］。本研究通过检测血清中血管内皮生长因子基因多态性位点－634G＞C的单核苷酸多态性，探讨先天性心脏病与血管内皮生长因子－634G＞C基因型的相关性。

1 资料与方法

1.1 临床资料

病例组为长春市儿童医院心外科收治的先天性心脏病患儿77例，其中男41例，女36例，年龄为6月龄－13岁，所有患儿均经过查体、超声心动图及手术明确诊断。对照组为长春市儿童医院门诊体检健康儿童共75例，其中男38例，女37例，年龄为5月龄－12岁，均经过超声检查已除外CHD，并且无其他先天性疾病或肿瘤，肝、肾功能均正常。所有对象均为汉族，两组年龄，性别差异均无显著性（P＞0.05）。

1.2 排除标准

具有以下一项者为排除病例，①新生儿期婴儿，卵圆孔未闭及动脉导管未闭存在，因两者仍有自行闭合的可能，不作为研究样本；②CHD患儿出现艾森曼格综合征，肺动脉压力极高，心内缺损的血流方向发生改变，血流动力学与未出现艾森曼格综合征的CHD患儿有差异，所以不作为研究样本；③CHD患儿合并有染色体疾病，如唐氏综合征，不作为研究样本。

1.3 方法

1.3.1 目的基因的提取和扩增 病例组及对照组患儿清晨空腹6小时以上，采集静脉血2ml，EDTA抗凝管保存，采集后2小时内，离心机3 500转／分，离心5分钟，抽出血浆，置2ml离心管中。血细胞及血浆均在－80℃冰冻保存。饱和酚－氯仿法提取DNA。Taqman探针检测VEGF－634G＞C的单核苷酸多态性。①紫外光／可见光分光光度法测定样本的DNA含量。②选择反应体系20μl：2XTaq－Man Master Mix 10μl，40XTaqman SNP Assays 0.5μl，样本DNA3μl，无核酸酶水6.5μl。③使用7500型实时荧光定量PCR仪，Taqman探针工作：步骤1：初活化50℃2min，步骤2：活化95℃10 min，步骤3：变性95℃15sec：，步骤4：退火／延伸60℃1min，步骤3和步骤4循环40次。④读取数据及生成结果图。

1.3.2 统计学方法 用SPSS 19.0软件进行统计学处理，对数据进行正态性检验，计量资料用x—±s表示。样本的均数比较，首先检验方差齐性，然后采用t检验。两组间比较采用成组χ2检验，P＜0.05为有统计学差异。

2 结果

2.1 VEGF－634G＞C的基因型

通过单核苷酸多态性检测，病例组和对照组的基因型有：纯合子GG型，杂合子GC型，纯合子CC型，见图1－3。如仅有红色曲线抬升，绿色曲线水平，基因型为纯合子GG型；如红色曲线和绿色曲线均有抬升，基因型为杂合子GC型；如红色曲线水平，绿色曲线抬升，基因型为纯合子CC型。

2.2 病例组和对照组VEGF－634G＞C等位基因频率的比较

病例组共有样本77个，－634G＞C多态性位点等位基因总数为154个，其中G基因103个，C基因51个；对照组共有样本75个，－634G＞C多态性位点等位基因总数为150个，其中G基因114个，C基因36个。两组等位基因G／C频率经χ2检验，χ2＝1.55，P＞0.05，差异无显著性，见表1。

图1 基因型GG指数图

图2 基因型GC指数图

图3 基因型CC指数图

表1 两组VEGF－634G＞C等位基因比较［n（%）］

2.3 病例组和对照组基因型GG、GC和CC频率的比较

病例组的基因型为三种，分别为：GG型38例，GC型27例，CC型12例；对照组基因型也为三种，分别为：GG型53例，GC型8例，CC型14例。病例组与对照组三种基因型的分布经χ2检验，χ2＝12.16，P＜0.05，差异有显著性，见表2。

表2 病例组和对照组VEGF－634G＞C基因型分布比较［n（%）］

2.4 VEGF－634G＞C基因型与CHD易感性

比数比（OR）：指病例组中暴露人数与非暴露人数的比值除以对照组中暴露人数与非暴露人数的比值。比数比是反映疾病与暴露之间关联强度的指标。如果OR＜1，说明疾病的相对危险度低，如果OR＞1，说明疾病的相对危险度高。本研究的病例组和对照组中，VEGF－634G＞C的基因型分为：GG型为91例、GC型35例、CC型26例。其中两组的GC型所占比例差异性大。GG型OR值为0.4，GC型OR值为4.5，CC型OR值为0.8。这说明在3种基因型中，GC基因型最易导致CHD的发生，它可能是CHD的易感基因型。见表3。

表3 VEGF－634G＞C基因型患CHD的比数比

3 讨论

CHD是小儿先天性畸形疾病中最常见的一类，并且也是小儿最常见的心脏病。我国CHD的发生率为6‰－8‰。近些年，CHD的发病率有逐渐上升的趋势［2］。CHD被认为是一种复杂性状疾病，它的形成原因主要与下列因素有关：1、遗传因素（内在因素）：如单基因突变，染色体畸变，多基因病变和先天性代谢紊乱；2、环境因素（外在因素）：孕早期风疹病毒感染，柯萨奇病毒感染，孕期摄取锂盐，糖尿病，酗酒，过量辐射，药物，高龄孕妇，高原地区生活等。VEGF是调节心脏血管生长发育的重要因子之一。VEGF－634G＞C多态性位点的突变，与CHD的形成密切相关［3］。

在本研究中发现，CHD患儿和健康儿童的VEGF－634G＞C的基因型均为三种：GG型，GC型和CC型。虽然两组的G／C等位基因频率无差异，但是两组基因型的分布有明显差异。其中，GC型在两组的差异性较大，并且GC型引起CHD的比数比为4.5，其余两型的比数比均＜1。所以，GC型可能是CHD发病的易感基因型。原因可能是：－634G＞C的不同的基因型其生理活性不同［4］。－634C的生理活性强于－634G。有研究发现，－634C可能会影响内部核糖体进入位点（IRES），使其表达增加。这样，VEGF的表达发生异常。另外有研究发现，VEGF影响心脏血管发育主要是受到VEGF的特异性受体控制：VEGF受体－1和VEGF受体－2［5］。这两种受体作用的协同效应，构成了新的血管形成的基础。VEGF的表达异常，可能与VEGF受体－1和VEGF受体－2结合程度就会有差异，导致内皮细胞的通透性发生变化，VEGF浓度的改变影响了心血管的发育，可能导致CHD的形成［6］。总之，在胚胎期心脏发育阶段，VEGF对心脏发育在时间上和空间上有非常准确的调控。一旦多态性位点－634G＞C发生突变，就有可能导致VEGF的表达异常，血中VEGF的浓度发生改变，影响VEGF对于心脏发育的调控，最终导致CHD的出现［7］。

在胚胎期，VEGF－634G＞C的基因突变后，影响了VEGF的表达。但是每个胎儿受到的影响的程度不尽相同，有的胎儿影响程度较轻，VEGF的浓度变化小，或者在正常范围内［8］。所以，这类的胎儿在发育过程中，心脏的发育仍然会按照正常的胎儿发育，没有形成CHD。同样，有的胎儿由于在胚胎时期，VEGF的表达受到的影响较大，VEGF的浓度低于或超过了正常范围，导致心脏的发育异常，最终形成了CHD［9］。因此，即使VEGF的多态性位点－634G＞C发生了突变，并且产生了易感CHD的基因型，但是也不一定形成CHD。至于VEGF基因突变后的具体的浓度变化，以及浓度变化对胚胎影响程度，有待于进一步研究［10］。

本研究仍有需要完善的地方：实验中两组的样本量小，无法对CHD进行分型研究；实验样本采集受到了国籍、地域及种族、环境的限制；VEGF有多个多态性位点。本实验只是针对－634G＞C这一个位点进行了探讨；实验中的样本未采集父母的血样，对评估CHD的遗传因素可能会有的影响。

本研究仅证明了VEGF－634G＞C的基因型与CHD的形成有相关性。但尚不能据此诊断胎儿是否患有CHD，也未探讨针对CHD形成的机制如何进行基因治疗。同时，鉴于CHD的形成有多种因素参与，多个基因位点的突变都有可能对CHD的形成机制产生影响［11］。所以，我们下一步可能需要扩大研究范围，探讨多基因变异的相互作用及其影响，在更深层次，更广区域研究CHD的形成机制以及如何有效的进行基因干预以减少发病率和死亡率。随着科学技术的发展，研究VEGF和CHD的进程可以与分子生物学，遗传学，环境学等学科相结合，为CHD的早期诊断及治疗提供理论依据和实践支持。

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2014－11－26）

1007－4287（2015）10－1749－03

＊通讯作者