原肌球蛋白3在大肠癌中的表达和意义

印 璞，李玲霞，高 申＊，宋丽娜，李洪军，何成彦

（1.吉林省临床检验中心，吉林长春130021；2.吉林大学中日联谊医院，吉林长春130033）

原肌球蛋白3在大肠癌中的表达和意义

印 璞1，李玲霞2，高 申2＊，宋丽娜2，李洪军2，何成彦2

（1.吉林省临床检验中心，吉林长春130021；2.吉林大学中日联谊医院，吉林长春130033）

结直肠癌（Colorectal cancer，CRC）是我国肿瘤发病率上升最快的肿瘤之一。全球每年结直肠癌新发病病例数可达94万，近50万人因结直肠癌死亡。结直肠癌患者无淋巴结转移的，术后五年生存率可达90%［1］，而发生淋巴结转移的，术后五年生存率仅为65%［2，3］。蛋白质组学技术在对实体肿瘤的分子标志物检测中显示出了特有的高灵敏度、特异度［4］。本研究以结肠腺癌组织、癌旁组织为研究对象，进行双向电泳和质谱分析，筛选结肠腺癌相关特异蛋白。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 临床资料 实验所需大肠癌组织标本取自吉林大学中日联谊医院就诊并手术治疗的大肠癌患者。标本离体后立即取材，放入液氮冷冻，－80℃保存。经病理学检查证实，所取大肠癌组织类型是Dukes C期腺癌。

1.1.2 试剂 固相pH梯度干胶条（pH3－10，17 cm；pH5－8，17cm）、矿物油、碘代乙酰胺（IAM）购自Bio－Rad公司（Hercules，CA，USA）、载体两性电解质。尿素、硫脲、精胺、三羟甲基氨基甲烷、CHAPS、丙烯酰胺、TMED、甘氨酸、十二烷基磺酸钠（SDS）、溴酚蓝、考马斯亮蓝G－250、苯甲基磺酰氟（PMSF）购于Sigma公司（St1Louis，MO，USA）。琼脂糖、甲叉双丙烯酰胺、二硫代苏糖醇（DTT）、TPCK修饰的测序级胰酶购自Promeg公司。过硫酸铵、碳酸氢氨、硝酸银、甲醛、乙醇、硫代硫酸钠、冰乙酸为国产分析纯。蛋白质定量试剂盒（RCDC Protein Assay Kit）购于Bio－Rad公司。液相色谱分析仪购自安捷伦公司，LTQXL离子肼质谱仪购自赛默飞世尔公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品总蛋白提取及蛋白浓度测定 分别取50mg癌组织及癌旁组织进行研磨，加入200μl预冷的组织蛋白抽提试剂，冰上放置20min。4℃，12 000g离心1小时，留取上清备用。用考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，在波长595nm处比色，以标准蛋白含量为横坐标，以A595nm为纵坐标绘制标准曲线，测定样品中蛋白质含量，分别分装并保存在－80℃备用。

1.2.2 样品蛋白水解多肽混合物的制备 取出冻存总蛋白样品，平衡至室温。用3－5倍体积的50 mM NH4HCO3溶解蛋白样品。加入1M的DTT，调定终浓度至20mM，56℃室温、避光放置1h。室温下加入1M的IAM，调定终浓度至50mM，室温、避光反应半小时。反应体系中按照蛋白：胰酶以50∶1比例加入，放在37℃水浴箱中过夜。酶切产物，－80℃冻干保存。

1.2.3 二维色谱与质谱联用分离并鉴定多肽混合物 将样本用缓冲液溶解，取50μg样本上样，经反相色谱洗脱的多肽用LTQXL离子肼质谱仪检测，质谱数据采用Thermo Fisher公司的Bioworks 3.3.1SP1软件，用SEQUEST进行数据库检索，以鉴定出相关多肽和蛋白质。

1.2.4 免疫印迹试验 采用免疫印迹试验对选定的目标蛋白－TPM3的表达情况进行进一步的验证。BCA法定量蛋白，使每个加样孔中蛋白量相同。TPM3单克隆抗体购于Santa Cruz。内参照为actin。

1.2.5 统计学分析 二维色谱与质谱联用图谱依据SEQUEST算法，使用SPSS13.0统计软件包进行t检验。P＜0.05为有显著性差异。

2 结果

2.1 肿瘤组织总蛋白酶解混合物的二维色谱与质谱联用分析

肿瘤组织总蛋白经酶解后，产物应用二维液相色谱与质谱联用分析，对获得的多肽质谱数据采集、整理，得到614个蛋白的鉴定资料。

2.2 癌旁组织总蛋白酶解混合物的二维色谱与质谱联用分析

癌旁组织总蛋白经酶解后，产物应用二维液相色谱与质谱联用分析，对获得的多肽质谱数据采集、整理，得到357个蛋白的鉴定资料。

2.3 肿瘤与癌旁组织差异蛋白质的质谱分析

本实验中应用谱图数来评价每个蛋白的丰度。对于蛋白丰度的变化，我们参照以下标准界定：（1）两个样品中蛋白谱图数的差值≥72；（2）两个样品中蛋白谱图数的比值≥1。

将肿瘤组织与癌旁组织的蛋白分析数据依据上述标准进行比对，得到有显著差异的蛋白共18个。TPM3的质谱图见图1。

图1 TPM3的质谱图

2.4 TPM3的免疫印迹结果 见图2。

图2 TPM3的免疫印迹图

3 讨论

大肠癌是发病率和死亡率都较高的肿瘤，结直肠癌早期的临床症状不明显，确诊时一般已发展到中晚期，丧失了治疗的最佳时期，因此对于肿瘤的早期诊断仍是研究的热点。蛋白质组学技术具有高度自动化、高效率、高通量等优势，且可以同时检测组织中全部的蛋白质，利用差异蛋白质组学分析，可以发现发病早期灵敏度高及特异性强的肿瘤标志物，对于肿瘤的早期诊断、早期治疗和预后的预测方面都具有非常重要的临床意义。

本研究对结肠腺癌组织、癌旁组织进行蛋白组学技术研究，选取两个样品中蛋白谱图数的差值≥72，并且两个样品中蛋白谱图数的比值≥1的蛋白进行质谱分析，最终鉴定出18种蛋白。这些表达有差异的蛋白是从结肠癌组织、癌旁组织中比较分析而来，故可认为是结肠癌相关蛋白。

原肌球蛋白（tropomyosin，TM）是肌肉收缩过程中重要的调节蛋白质，广泛分布于各种真核细胞中，迄今为止尚未发现在原核细胞中存TM。目前，TM中的4个基因已被确认，分别被命名为：TPM1（或α－TM）、TPM2（或β－TM）、TPM3（或γ－TM）、TPM4（或δ－TM）［5］。它们与细胞转化密切相关。TM家族表达下调可以导致细胞向恶性转化，恢复其表达水平，可以阻止细胞恶性转化进程［6］。TPM3基因，即γ－TM基因，编码含284个氨基酸残基的成纤维细胞LMWTM30nm即TM5，和含284个氨基酸残基的慢收缩骨骼肌HMWA－Tm即TM3，迄今在平滑肌中尚未确认有该基因产物。

在试验中我们发现，TPM3在结肠癌组织中表达明显下降，再运用蛋白免疫印迹实验，其结果与双向电泳一致。证明了在大肠癌组织中TPM3的含量明显低于癌旁组织，有研究表明，在肝癌、食管癌、慢粒等肿瘤中TPM3的含量与正常组织都有明显差异［7，8，9］。这说明TPM3在多种肿瘤的发生、发展过程中起到了一定的作用。本研究中发现TPM3在结肠癌组织中表达下降，提示TPM3可能在结肠癌中扮演癌症抑制因子的重要角色，可能成为结肠癌诊断的分子标记物，但要将其应用于临床诊断和治疗仍有待进一步的研究。

［1］Cancer Facts ＆Figures 2011［R］.American Cancer Society，2011.

［2］Hawk ET，Levin B.Colorectal cancer prevention［J］.J Clin Oncol，2005，23（2）：378.

［3］Ruo L，Gougoutas C，Paty PB，et al.Elective bowel resection for incurable stage IV colorectal cancer：prognostic variables for asymptomatic patients［J］.J Am Coll Surg，2003，196（5）：722.

［4］Posadas EM，Simpkins F，Liotta LA，et a.l Proteom ic analysis for the early detection and rational treatment of cancer－realistic hope［J］.AnnOncol，2005，16（1）：16.

［5］Lees JG，Bach CT，O＇Neill GM.Interior decoration：tropomyosin in actin dynamics and cell migration［J］.Cell Adh Migr，2011，5（2）：181.

［6］Prasad GL，Masuelli L，Raj MH，et al.Suppression of src－induced transformed phenotype by expression of tropomyosin－1［J］.Oncogene，1999，18（11）：2027.

［7］Zhipeng Li，Rong Yang，Jiangning Zhao，et al.Molecular Diagnosis and Targeted Therapy of a Pediatric Chronic Eosinophilic Leukemia Patient Carrying TPM3－PDGFRB Fusion［J］.Pediatr Blood Cancer，2011，56：463.

［8］Maryam Zare，Ferdous Rastgar Jazii，Zahra－Soheila Soheili，et al.Downregulation of Tropomyosin－1in Squamous Cell Carcinoma of Esophagus，the Role of Ras Signaling and methylation［J］.Molecular Carclnogenesis，2012，51：796.

［9］Lam CY，Yip CW，Poon TC，et al.Identification and Characterization of Tropomyosin 3Associated with Granulin－Epithelin Precursor in Human Hepatocellular Carcinoma［J］.PLoS ONE，2012，7（7）：e40324.

2014－10－09）

1007－4287（2015）10－1733－03

吉林省科技厅（2011713，20090461，2010739）；吉林省发改委（2013c026－5）；长春市科技局（2011125）

＊通讯作者