甲型H1N1流感住院患者病毒核酸与淋巴细胞百分比的相关性分析

刘秀红，赵一鸣，李 莉，张 欣，孙莉波，闫惠平＊，李 宁＊

（1.首都医科大学附属北京佑安医院，北京100069；2.北京市肝病研究所，北京100069；3.北京协和医院基本外科，北京100005）

甲型H1N1流感住院患者病毒核酸与淋巴细胞百分比的相关性分析

刘秀红1，2，赵一鸣3，李 莉1，张 欣1，孙莉波1，闫惠平1＊，李 宁1，2＊

（1.首都医科大学附属北京佑安医院，北京100069；2.北京市肝病研究所，北京100069；3.北京协和医院基本外科，北京100005）

目的通过对2009年6月1日－2009年12月8日北京佑安医院收治的191例（死亡8例）甲型H1N1流感病毒感染确诊住院病例的分析，了解发病期间H1N1病毒感染患者H1N1病毒核酸及淋巴细胞百分比的变化趋势以及二者之间关系，以期为临床提供简单易掌握的诊断数据。方法 用实时RT－PCR检测H1N1病毒核酸及血常规，并对191例患者的临床资料进行回顾性分析。结果 H1N1病毒感染患者的病毒核酸阳性率与淋巴细胞百分比呈强负相关性（r＝－0.950，P＜0.001）；H1N1病毒感染且并发肺炎的患者H1N1病毒核酸为阴性时其淋巴细胞百分数大于病毒核酸阳性时的淋巴细胞百分数（42.96±2.50＞31.63±3.03，P＜0.01）；在发病前7天，随着发病天数的增加，肺纹理清晰的患者淋巴细胞百分数有平滑上升趋势，而肺纹理增粗和肺炎的患者的淋巴细胞百分数上升趋势呈巨齿样波动；8例死亡病例死亡前的淋巴细胞百分比均低于20%，并在5%－15%范围内无规律波动。结论 甲型H1N1病毒能引起淋巴细胞数量上的降低，患者淋巴细胞百分比的高低变化趋势在一定程度上预示病情的轻重，当淋巴细胞百分比持续小于20%，预示病情危重。

H1N1病毒；核酸；淋巴细胞百分比；住院患者

（Chin J Lab Diagn，2015，19：1717）

世界卫生组织（World Health Organization，WHO）在2009年4月，先次报告了在墨西哥检测出一种人感染的新型猪来源的甲型流感病毒（novel swine－origin influenza A virus，S－OIV）［1］。为避免误解，WHO宣布将这种新的流感重新命名为“甲型H1N1流感”，其病毒称为“人A／H1N1病毒”（本文称H1N1病毒）。此病毒自发现之日起到2009年7月，几乎传播到全世界所有国家，引起800多人死亡，这是自1968年H3N2暴发以来最大一次人类流感病毒的流行［2］。为了控制此疾病的流行，我国于2009年4月30日宣布将其纳入《中华人民共和国传染病防治法》规定的乙类传染病，并按甲类传染病的预防、控制措施及《中华人民共和国国境卫生检疫法》规定的检疫传染病进行管理，建立起有效的每天零报告制度，由定点医院对确诊病例进行住院隔离观察治疗，并且在监测的后期，从确诊的H1N1患者中识别出危重患者成为了工作重点。

新甲型H1N1流感病毒为单股负链RNA病毒，基因组约为13.6kb，序列分析结果显示，该流感病毒为四重配病毒，其基因组8个片段分别来源于近年来流行的4种病毒：NA（神经氨酸酶）和M（基质蛋白M1、M2）片段来源于1979年以来流行于欧亚大陆的猪流感病毒；HA（血凝素）、NP（核蛋白）和NS（非结构蛋白）片段来源于北美普通猪流感病毒；PB2（RNA聚合酶亚基）和PA（RNA聚合酶亚基）片段来源于禽流感病毒；而PB1（RNA聚合酶亚基）来源于人季节性H3N2流感病毒［3］。由于人群对新流感病毒缺乏免疫力因而造成每次流感的大流行，而抗原漂移和抗原转换是甲型流感病毒发生变异的重要原因。所以，WHO认为，人们对于流感还知之甚少，只有从已往流感治疗中吸取成功经验。由于北京佑安医院是收治新型甲型H1N1流感患者的定点医院，我们有住院患者发病过程中实验室纵向多时间点的检测数据，而这些实验室数据却很少有人报道，本文回顾性分析了H1N1核酸和血常规的数据，希望找到一个简单易得的判断预后指标，有助于人们更好了解H1N1流感。

1 资料与方法

1.1 临床资料

回顾分析2009年6月1日至2009年12月8日由北京佑安医院收治的H1N1病毒感染的确诊住院病例191例，确诊病例诊断标准参照卫生部《甲型H1N1流感治疗方案2009年试行版第一版》［4］，实验室诊断主要是采集鼻咽拭子标本进行H1N1病毒的PCR检测。具体如下：北京佑安医院检测H1N1病毒核酸为阳性的标本全部送到北京市疾病控制中心再进行进一步的核实，并由专家小组成员依据诊断标准讨论确定。191例患者中有8例为死亡病例，男性5例，女性3例，（男∶女＝1.7∶1），平均年龄为48.38岁（22岁－74岁）。另外的183例患者（包括13例隐性感染患者），52.5%为男性（96／183例），47.5%为女性（87／186例），男∶女＝1.1∶1，平均年龄为22.27岁（1岁－79岁）；其中并发肺炎18例（9.8%）、支气管炎3例（1.64%）、哮喘3例、糖尿病、高血压和急性肠炎各1例。患者的临床表现多以一种或几种流感样症状为主，如发热、咳嗽、咳痰、咽痛、流涕、鼻塞、肌肉酸痛、头痛、乏力、畏寒等，还有腹泻、呕吐等肠道感染症状。严重者可出现肺炎、呼吸衰竭、多器官功能损伤等并发症，甚至死亡。

1.2 实验室检测方法

1.2.1 H1N1病毒核酸提取 用RNA提取试剂盒（德国Qiagen公司，试剂编号：52904）从取自患者的咽拭子中提取病毒RNA，具体步骤按试剂盒说明操作。

1.2.2 H1N1病毒核酸检测 （1）方法。应用实时逆转录－聚合酶链反应方法（real time reverse transcription－polymerase chain reaction，real time RTPCR）；（2）仪器。PCR仪（ABI7500，美国）；（3）试剂。Quanti Tect R Probe RT－PCR试剂盒（德国Qiagen公司，试剂编号：204443）。检测的扩增引物基因片段包括①甲型流感病毒通用引物M基因（infA－M）；②猪甲型流感病毒A型通用引物NP基因（SW infA－NP基因）；③猪H1N1流感病毒特异引物HA基因（SW H1－HA基因）；④内参基因人核糖核酸酶P（RNase P）。具体引物和探针序列请参见WHO所公布的信息［5］，具体操作步骤参见试剂盒说明书。

1.2.3 血常规 取患者2ml抗凝血，用日本sysmex KX－21全自动血液分析仪检测。血常规包括血红蛋白、红细胞计数、白细胞计数和白细胞分类，白细胞分类包括淋巴细胞、中性粒细胞和中间细胞（嗜酸细胞、嗜碱细胞和单核细胞）。

1.3 统计方法

采用SPSS 11.5统计软件进行数据处理，计量资料用平均值±标准差表示，进行独立样本t检验、配对t检验、方差分析，相关性分析用直线相关与回归分析，P＜0.05为差异有统计学意义，P＜0.01为差异有非常显著性统计学意义。

2 结果

2.1 H1N1病毒RNA阳性率与淋巴细胞百分数呈负相关性

本文的H1N1核酸阳性率计算如下：在发病的第n天时，共检测M＋N例患者，有N例患者H1N1核酸为阳性，M个患者H1N1核酸为阴性，则H1N1核酸阳性率＝N／N＋M，阴性率＝M／N＋M。我们分析了的170例H1N1确诊患者（不包括没有症状的隐性感染者13例及死亡病例8例），从图1A可见，随着发病天数从第1天到11天的延长，H1N1病毒核酸的HA基因、NP基因和M基因的阳性率均呈逐渐下降的趋势。从发病第二天到第十天，H1N1核酸阳性率从小到大依次是HA、NP和M基因，也就是说HA基因由阳性转为阴性的速度最快，而M基因阳转阴的速度最慢。在发病第七天，HA基因、NP基因和M基因的阴性率分别为93.3%（84／90例）、88.4%（76／90例）和65.6%（59／90例）。由于HA、NP和M基因的阳性率的变化趋势一致，均呈45度角斜线下降趋势，所以将HA、NP和M基因的阳性率三者取平均值，并与淋巴细胞百分比相比较，从图1B可见，随着发病天数增加，尤其是第一天到第七天，淋巴细胞百分比呈逐渐上升趋势，变化范围从25.5%到41.9%，而H1N1核酸阳性率的变化趋势与淋巴细胞百分比正好相反呈逐渐下降趋势，变化范围从94.8%到0%，二者的相关系数r＝－0.950，双侧Pearson检验P＜0.001，有显著统计学意义，说明淋巴细胞百分比与H1N1核酸阳性率呈高度负相关性，也就是说随着淋巴细胞数量逐渐增多，H1N1核酸阳性率逐渐降低，阳转阴率逐渐增多。回归方程为：Y（H1N1核酸阳性率）＝232.034－5.483X（淋巴细胞百分比），确定系数R2＝0.902，表示H1N1核酸阳性率的降低有90.2%可由淋巴H1N1细胞百分数的增多来解释的，一般来说，R2值越大，回归方程越有价值。

图1 H1N1核酸阳性率与淋巴细胞百分数成负相关性

2.2 不同患者的H1N1 RNA阳性与阴性时的淋巴细胞百分率的变化情况

2.2.1 从图2A可见，H1N1病毒感染且并发肺炎的18例患者，当H1N1病毒核酸为阴性时，其淋巴细胞百分数为42.96±2.50，大于病毒核酸阳性时的淋巴细胞百分数31.63±3.03，差异有显著的统计学意义（P＜0.01）；而H1N1隐性感染13例患者，病毒核酸阳性组的淋巴细胞百分数为31.86± 3.56，与病毒核酸阴性组的淋巴细胞百分数30.86 ±2.48相比，差别没有统计学意义（P＞0.05，见图2B）。

图2 不同患者的H1N1 RNA阳性组与阴性组之间的淋巴细胞百分率

2.2.2 在170例H1N1病毒感染住院患者中，肺部胸片示肺纹理清晰40例，肺纹理增强12例，肺炎18例。由于肺纹理增强与肺炎患者的淋巴细胞百分比均在核酸阳性和阴性时差异没有统计学意义（数据没表示），为了增大观察例数我们将肺纹理增强和肺炎的患者归为一组共30例，与肺纹理清晰40例患者进行比较。从图3可见，在发病第一天和第二天，肺纹理增强和肺炎患者的淋巴百分比（＜20%），明显低于肺纹理清晰者的淋巴百分比（＞25%），差异有显著的统计学意义（P＜0.01）。随着发病天数的增加，尤其是发病的前7天，40例肺纹理清晰患者的淋巴细胞百分比呈平滑上升趋势，与不包括隐性感染的170例H1N1病毒感染住院总体患者淋巴细胞百分比的变化趋势相同，而肺纹理增粗和肺炎的30例患者，其淋巴细胞百分比在发病早七天呈锯齿样波动上升趋势（见图3）。

2.3 死亡病例的淋巴细胞改变

8例死亡患者在死亡前的第2－16天，H1N1病毒核酸已由阳性转为了阴性，在血、痰和尿培养标本均没检测出到H1N1病毒。从图4可见，只有一位患者在一天（死亡前第9天）的一个检测时间的淋巴细胞百分比为20.9%，其他患者在1－4次／天的检测频率中，淋巴细胞百分比均小于20%，并且在5%到15%范围内无规则的变化。T细胞亚群检测结果见表1，4例死亡患者平均的CD3＋、CD3＋CD4＋、CD3＋CD8＋的绝对数和CD4＋／CD8＋平均值分别为396.38个／μl，209个／μl，183.75个／μl和1.14个／μl，除CD4＋／CD8＋外，前三者数值远远低于正常值（1242±404个／μl，651±209个／μl，524±283个／μl和1.5－2.0），仅为正常值的1／3左右。

3 讨论

由于H1N1流感病毒由猪、禽和人三源四基因重配而成［6］，用实时RT－PCR检测呼吸道标本（咽拭子、口腔含漱液、鼻咽或气管抽取物、痰）中的甲型H1N1流感病毒核酸是当时最主要可行的检测手段。WHO推荐检测H1N1病毒的扩增引物基因片段包括甲型流感病毒通用引物M基因、猪甲型流感病毒A型通用引物NP基因和猪H1N1流感病毒特异引物HA基因，并且判读H1N1阳性的标准是M基因阳性，再加上NP或HA有一个阳性。我们观察到随着发病时间的延长，HA、NP和M基因的阳性率均呈逐渐下降趋势，但是三者由阳性转为阴性的速度是不一样的，由快到慢依次为HA、NP和M基因，这与流感病毒最易发生抗原性变异，其中变异率最高的是HA基因［7］是否有关有待进一步研究。

图4 8例死亡患者死亡前的淋巴细胞百分比变化趋势

表1 4位死亡患者T淋巴细胞亚群的绝对计数和比值

3.1 淋巴细胞与H1N1病毒核酸阳转阴相关

当病毒感染人体后定会影响到人体免疫系统［8］，而淋巴细胞是人体的重要免疫细胞。本文主要分析了血常规中白细胞计数及白细胞分类中的数据，我们观察到170例H1N1患者的淋巴细胞和中性粒细胞绝对值大小与白细胞计数多少的变化趋势相一致，而中间细胞则基本保持在一个水平，不随白细胞计数的多少而有所变化（资料没显示）。淋巴细胞百分比随发病天数的增加在正常范围内呈上升趋势，而中性粒细胞百分比则与之相反在正常范围内呈下降趋势（资料没显示）。当白细胞计数变化时，淋巴细胞百分比也随着变化，淋巴细胞百分比的高低不仅能了解淋巴细胞在白细胞中所占比例的高低，也能了解淋巴细胞绝对值的高低，并且淋巴细胞百分比数值变化范围远小于淋巴细胞绝对值，所以本文主要对变化范围相对小的淋巴细胞百分比进行了观察分析。将淋巴细胞百分比高低分为高（＞40%）、中（20－40%）、低（＜20%）三组，可观察到在发病后的前四天内，高淋巴细胞百分比组的核酸阴性百分比最高，说明淋巴细胞数量多时（可能免疫细胞没被破坏或机体免疫力增高）有利于H1N1病毒阳转阴（数据没显示）。随着发病天数的增加，本文观察到淋巴细胞百分比是逐渐升高的，与H1N1病毒核酸阳性率下降呈极好的负相关性，间接说明淋巴细胞百分比与H1N1病毒核酸阳转阴有强的正相关性。两者的关系的解释可能是病毒进入人体后破坏了人体免疫细胞，使淋巴细胞减少，随着用药治疗，病毒被控制了，淋巴细胞数量得已恢复升高，也可能是人体产生了大量淋巴细胞，有利于病毒的清除。

3.2 淋巴细胞百分比高低与病情严重程度相关

Eun Lee研究［9］表明儿童H1N1感染并发肺炎时淋巴细胞绝对值及比率与没有肺炎患者相比更低。我们观察H1N1感染并发肺炎的患者（病情重的），当其H1N1病毒核酸为阴性时的淋巴细胞百分数是大于病毒核酸阳性时的淋巴细胞百分数的，说明淋巴细胞数量增多有利于病毒的清除；而H1N1隐性感染患者（病情轻的），无论病毒核酸是阳性还是阴性，淋巴细胞百分比组差别没有统计学意义，说明隐性感染者所感染的H1N1病毒毒力相对弱，淋巴细胞在数量上没有太大的改变，这从另一侧面似乎又说明病情的严重性与核酸是否阴阳无关，而与淋巴细胞的多少有关。我们观察到另一个有趣现象，胸片肺纹理增强与肺炎的患者同胸片肺纹理清晰患者一样，随发病天数的增加，淋巴细胞百分比均呈上升趋势，只是前者上升的道路是曲折的，而后者上升是平滑的，原因可能是在发病最初前者的淋巴细胞百分比低于后者，所以淋巴细胞数量的恢复比较困难，但还是呈一个上升趋势。随后我们分析了8例死亡病例，可以观察到淋巴细胞百分比在5%到15%范围内无规则上下波动，没有上升趋势，8例死亡病例的淋巴细胞百分比在多时间点的多次检测中始终小于20%，只有一个患者在一个检测时间有一次淋巴细胞百分比为20.9%。而这期间的8位患者H1N1病毒核酸已由阳性转为了阴性，充分证明淋巴细胞数少预示着病情危重。通常认为人体抵御外来病毒的侵袭主要依赖T淋巴细胞介导的细胞免疫起作用，当流感病毒入侵后，CD8＋T细胞与抗原特异性结合，在共刺激分子和CD4＋T细胞的帮助下增殖分化成为特异性的细胞毒T细胞，释放穿孔素和颗粒酶等物质，清除病毒。EJ等［10］研究表明H1N1流感患者与健康人相比，在发病的前2天，CD4＋T细胞和CD8＋T细胞是减少的。Toapanta等［11］实验证明老年大鼠因对流感病毒所激活的特异CD8＋T细胞百分率减少引起病毒清除和疾病恢复的延迟。通过对4例死亡患者T细胞亚群CD3＋、CD3＋CD4＋、CD3＋CD8＋的绝对数和CD4＋／CD8＋的检测，了解到CD4＋T细胞和CD8＋T细胞数量大大减少，有2例患者CD4＋T细胞和CD8＋T细胞的数值＜200个／μl（此数值是获得性免疫缺陷综合征艾滋病期患者的水平），CD4＋／CD8＋小于1.5，进一步说明，CD4＋T细胞比CD8＋T细胞减少的更多，而人体的免疫功能有赖于两者数量上的平衡。

总之，本文从纵向多时间点的血常规检测数据入手，发现淋巴细胞百分比与H1N1病毒核酸的阳转阴率成正相关性，并且证明，既使H1N1病毒核酸转阴了，如果随着发病天数的增加，淋巴细胞百分比没有升高，并且淋巴细胞百分比总是＜20%时病情是相当危重的。这一研究结果一方面有助于临床医生通过一个简单易得的指标尽早从甲型H1N1流感患者中识别出危重患者来，另一方面，也有助于人们深入进行T淋巴细胞介导的细胞免疫清除病毒的机制研究，这样，更有助于人们控制好H1N1流感的大流行。

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［3］林 磊，童贻刚，祝庆余.新甲型H1N1流感病毒及疫情分析［J］.军事医学科学院院刊，2009，33（3）：201.

［4］中华人民共和国［EB／OL］2009－5－8.http：www.moh.gov.cn／publicfiles／business／htm／files／mohwsyibgs／s9990／200905／40478.htm.

［5］CDC protol of real time RT－PCR for FluA（H1N1）28April 2009（pevisonal：30April 2009revision 2：6October 2009）.http：／／www.who.int／csr／resources／publications／swine flu／CDC real－time RT PCR－swine H1Assay－2009－20090430－pdf）.

［6］李 刚.甲型H1N1流感病毒的分子特征［J］.首都医科大学学报，2009，30（3）267.

［7］卫生部文件：甲型H1N1流感诊疗方案（2009试行版第二版）.

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Analysis correlativity between viral nucleic acid and lymphocyte percentage on 191 hospitalized patient with pandemic in－fluenza A

LIU Xiu－hong，ZHAO Yi－ming，LI Li，et al.
（Beijing YouAn Hospital，Capital Medical University；Beijing Institute of Hepatology，Beijing100069，China）

ObjectiveTo know correlativity between pandemic influenza A（H1N1）viral nucleic acid and lymphocytes percentage（lymph%）of 191patients with H1N1viral infection treatment in YouAn hospital on 1June－8December 2009were useful to provide diagnosis data for doctors.Methods Specimens of H1N1inpatients were tested by haemocyte counts and by real time RT－PCR（polymerase chain reaction）.The same time，191case histories were analyzed retrospectively.Results A strong negative correlativity between positive percent of nucleic acid and the lymph%was certified along with onset time extension（r＝－0.950，P＜0.001）.of the H1N1viral infection patients complicated by pneumonia was higher than those with negative percent of viral nucleic acid（42.96±2.50VS 31.63±3.03，P＜0.01）.Within 7days after onset，the lymph%of patients with clear pulmonary markings was elevation more smoothly than patients with pneumonia and thickness pulmonary markings.The lymph%of 8died patients were persistently less 20% and fluctuation scope was at 50－15%.Conclusion The lymphocyte amount of patients with H1N1influenza virus infection were low resulting from invasion of H1N1influenza virus.The change tendency of lymphocytes percentage indicated the patients’state of the illness.The less 20%persistently and the curve fluctuation of the lymph%imply that the pathogenetic condition was very severe.

H1N1；hospitalized patients；viral nucleic acid；lymphocytes percentage

R511.7

A

刘秀红（1965－），女，副主任技师，博士，主要从事传染病检测早期诊断研究。

2014－11－15）

1007－4287（2015）10－1717－06

佑安肝病艾滋病基金资助科研课题（BJYAH－2011－022，BJYAH－2011－002）

＊通讯作者