miRNA在重度子痫前期与正常妊娠胎盘组织中差异表达的研究

蒋涛涛，孙 波，沈 梅，董 洁，骆 琦

（深圳市第二人民医院（安徽医科大学深圳二院临床学院），广东深圳518035）

miRNA在重度子痫前期与正常妊娠胎盘组织中差异表达的研究

蒋涛涛，孙 波＊，沈 梅，董 洁，骆 琦

（深圳市第二人民医院（安徽医科大学深圳二院临床学院），广东深圳518035）

目的分别检测重度子痫前期和正常妊娠妇女胎盘组织中微小RNA（miRNA）的表达情况，并初步探讨miRNA的差异表达在重度子痫前期发生发展过程中的意义。方法 在我院住院剖宫产分娩的产妇中，选取5例重度子痫前期患者（实验组），5例正常妊娠孕妇（对照组），通过miRNA芯片技术检测实验组与对照组胎盘组织中miRNA的表达情况。结果 本实验共检测了391个miRNA的表达谱，实验组与对照组组间比较，差异表达的miRNA共有81个，其中表达上调的有80个，表达下调的有1个，主要涉及细胞分化、血管重塑、内分泌调节等多方面的功能。结论 重度子痫前期患者胎盘组织中miRNA的表达失调可能参与了重度子痫前期的发病及病理生理过程。

重度子痫前期；胎盘；miRNA；差异表达

（Chin J Lab Diagn，2015，19：1707）

子痫前期（preeclampsia，PE）是以高血压、蛋白尿等为主要临床症状的妊娠期特有疾病，国外统计其发生率为2%～8%，与孕产妇妊娠期死亡、早产及新生儿死亡密切相关［1］。其发病机制尚不清楚，但目前研究认为胎盘的病理状态与其相关［2，3］。微小RNA（m i R N A）属于单链非编码RNA，长约22个核苷酸，主要在基因的表达调控中发挥重要作用［3］。近年研究发现，胎盘组织中miRNA表达失调可能参与了重度子痫前期的发生，然而不同研究检测出的差异表达的miRNA不尽相同［3－7］。为进一步研究miRNA与重度子痫前期的相关性，本实验应用miRNA芯片技术比较sPE患者和正常妊娠孕妇的胎盘组织中miRNA的表达情况，并初步探讨miRNA在重度子痫前期病理生理过程中的作用机制。

1 资料和方法

1.1 一般资料 选取2014年3月至2014年5月期间在我院住院分娩的单胎初产妇共10例，其中5例sPE患者作为实验组，5例正常妊娠孕妇作为对照组，两组在年龄和孕周方面无统计学差异（P＞0.05），研究对象既往均无特殊病史，重度PE诊断标准依据苟文丽主编的《妇产科学》第八版标准。

1.2 方法

1.2.1 标本采集 胎盘娩出后5min内，在胎盘母体面无钙化区和出血点的部位采集数块面积约1× 1cm的胎盘组织，并在生理盐水中反复漂洗去除血污，干纱布吸除水分后及时放入液氮中，－80℃的冰箱保存。

1.2.2 样本总RNA的提取质检和纯化 按照Trizol法（北京博奥晶典）提取各个胎盘组织的总RNA，先予分光光度计定量，随后通过甲醛变性胶电泳试验质检总RNA的质量是否合格。对质检合格的总RNA使用mirVanaTMmiRNA Isolation Kit（AM1561）进一步纯化，并在纯化后再次用分光光度计定量。

1.2.3 纯化RNA的去磷酸化及标记 取纯化后的RNA 200ng，使用Agilent公司的miRNA Complete Labeling and Hyb Kit，主要步骤包括：①纯化后的miRNA5’端磷酸基团使用碱性磷酸酶CIP去除，此步为去磷酸化；②使用试剂盒中的T4RNA链接酶把Cyanine3－pCp连接到RNA3’端，完成标记；③将浓缩抽干的miRNA放在杂交炉中过夜，完成杂交。备注：标记外标（Labeling spike－in）RNA和杂交外标（Hyb spike－in）RNA作为整个实验过程中的质控。

1.2.4 芯片清洗及扫描 先将过夜杂交的芯片置于2×SSC和0.2%SDS的混合洗液中浸泡5min，甩干玻片，再置于0.2×SSC洗液浸泡5min，洗液温度均控制在42℃左右，甩干玻片，将芯片置于使用Agilent芯片扫描仪（G2565CA）中扫描获得杂交图片。

1.2.5 统计学处理 杂交图片使用Agilent Feature Extraction（v10.7）软件进行分析后获得原始数据，原始数据需经Agilent GeneSpring软件进一步统一化处理，随后即可用GeneSpring软件对处理后的数据统计分析。FC表示两组或两个样品之间的差异倍数；以2为底、Log FC的绝对值为幂得到的对数即为FC（abs），FC（abs）值越大，表示两个样品之间的差异越大。差异表达基因筛选标准：FC（abs）＞2.0，且P＜0.05。

1.2.6 miRNA靶基因预测 通过序列查询http：／／www.mirbase.org／index.shtml和靶基因预测http：／／www.umm.uni－heidelberg.de／apps／zmf／mirwalk／index.html初步探究差异表达的miRNA在重度子痫前期病理生理过程中的调节作用。

2 结果

本实验共检测出81个差异表达的miRNA，其中仅miR－135b－5p表达下调，其余80个miRNA均表达上调，目前有16个miRNA已知其在染色体定位及靶基因，见表1，其中miR－188－5p、miR－362－3p和miR－532－3p位于同一基因簇Xp11.23上。

表1 实验组表达上调的miRNA

3 讨论

miRNA在真核生物体内普遍存在，其长度约22个核苷酸，作为独立转录单位表达的单链的非编码RNA，其本身不包含蛋白质编码区，而是通过与靶mRNA的3’UTR完全或不完全互补配对结合，进而导致其靶mRNA降解或抑制其蛋白质翻译，从而在细胞发育、分化、凋亡等细胞生物学过程中发挥其基因调控作用。miRNA的生物学特性包括进化高度保守性、组织特异性、表达时序性，且不同的miRNA可位于染色体的同一部位共同发挥调控作用即基因的簇集性［3，8］。目前miRNA的功能研究尚处于起始阶段，绝大多数的miRNA的染色体定位及靶基因尚不清楚，仅初步开展了少部分的miRNA的功能研究。自Pineles等［4］首次发现miRNA在子痫前期和正常妊娠孕妇胎盘组织中的差异表达，国内相继开展了为数不多的相关研究［9－11］，但其检测基因的范围较小，基因的检测方法各不相同，此外各研究的实验结果存在较大差异。本实验采用基因芯片技术，可以在短时间内高通量、大规模的鉴定所有已知的391个miRNA的表达谱，并通过sPE组和对照组的组间比较，共检测出81个差异表达的miRNA。

实验中miR－210表达上调，与既往研究相一致［4，9，12］。Enquobahrie DA等［12］发现miR－210主要参与内皮细胞对低氧状态的应答、毛细血管样结构的形成以及VEGF趋化的细胞迁移等过程，其表达增量可能与胎盘低氧状态有关。ZHANG等［13］发现妊娠早期的低氧环境诱导了NF－κB的活性上升，激活了miRNA－210／HOXA9及miRNA－210EFNA通路，进而抑制滋养层细胞的正常分化和血管重塑，造成滋养细胞功能障碍、螺旋小动脉重铸不足和内皮细胞损伤，从而参与PE的发生。综合考虑sPE患者胎盘组织处于缺氧状态，可以推测miR－210在重度子痫前期的病理过程中其起重要作用。miR－125a－3p位于19q13.3，其靶基因ANP是由21～35个氨基酸残基组成的多活性肽，ANP的主要生理功能［14］是抑制炎性介质和血管活性物质的合成和释放及免疫调节功能。正常妊娠时孕妇体内的扩血管活性物质增加、缩血管物质减少以维持子宫胎盘血流，国外研究发现PE患者的胎盘和血浆中NO水平降低而炎性介质增加［15］，从而造成血管内皮细胞损伤及血管痉挛；ANP可减少CD4（＋）、CD8（＋）细胞，增加CD4（－）、CD8（－）细胞，并促进CD4（＋）向Th2和Th17细胞分化，外周血免疫相关基因的差异表达可能是sPE的发病原因之一［16］，重度子痫前期患者的胎盘及全身均存在着炎症反应的过度激活，影响子宫螺旋动脉的重铸，并降低母体对胚胎和胎儿的免疫耐受。同时ANP通过减少肾素分泌、抑制醛固酮分泌、对抗血管紧张素和抗醛固酮，导致电解质平衡的紊乱，而重度子痫前期患者有水钠储留、全身小血管痉挛、血压增高等病理生理学变化。由此可推断miR－125a－3p在PE的发生发展中发挥重要作用。miR－134位于人类印记基因区（14q32.31），印记基因在遗传学上不遵循孟德尔定律，只传递父系或母系单方的遗传信息，另一系不传递或者传递后表达极弱，即印记基因呈亲源依赖性的单等位基因表达。既往研究表明，印记基因可在人类及小鼠的胎盘生长、胎儿生长发育过程中发挥起调控作用［1720］。miR－134表达上调可能与胎盘的缺血缺氧病理状态密切相关，因而参与sPE的病理生理过程。鉴于miRNA在sPE和正常妊娠孕妇胎盘组织中的明显差异表达，国内外有学者提出miRNA可以作为无创性产前诊断的分子标记物，在高危人群出现PE症状前有效的预测疾病的发生，用于sPE早期的预测［21，22］。

虽然目前仅有少部分miRNA的功能被初步阐明，绝大多数功能尚不清楚，但本实验中检测出的部分差异表达的miRNA，其靶基因与重度子痫前期的病理生理学基础密切相关，可以推断miRNA的表达失调可能参与了重度子痫前期的发生发展过程，其具体的作用机制及途径尚待进一步研究。

［1］Ghulmiyyah L，Sibai B.Maternal mortality from preeclampsia／eclampsia［J］.Semin Perinatol，2011，36（1）：56.

［2］李东红，杨梦庚.胎盘与妊高征发病的关系［J］.中华妇产科杂志，1994，29（11）：687.

［3］Noack F，Ribbat－Idel J，Thorns C，et al.miRNA expression profiling in formalin－fixed and paraffin－embedded placental tissue samples from pregnancies with severe preeclampsia［J］.J Perinat Med，2011，39（3）：267.

［4］Pineles BL，Romero R，Montenegro D，et al.Distinct subsets of microRNAs are expressed differentially in the human placentas of patients with preeclampsia［J］.Am J Obstet Gynecol，2007，196（3）：261.

［5］Hu Y，Li P，S.Hao S，et al.Differential expression of microRNAs in the placentae of Chinese patients with severe pre－eclampsia［J］.Clin Chem Lab Med，2009，47（8）：923.

［6］Zhu XM，Han T，Sargent IL，et al.Differential expression profile of microRNAs in human placentas from preeclamptic pregnancies vs normal pregnancies［J］.Am J Obstet Gynecol，2009，200（6）：661.

［7］Mayor－Lynn K，Toloubeydokhti T，Cruz AC，et al.Expression profile of microRNAs and mRNAs in human placentas from pregnancies complicated by preeclampsia and preterm labor［J］.Re－prod Sci，2011，18（1）：46.

［8］Well M.The pathology of gestational trophoblastic disease：recent advances［J］.Pathology，2007，39：88.

［9］朱晓明，李 怡，姜 锋，等.子痫前期与正常胎盘组织中微小RNA的表达差异及其临床意义［J］.现代医药卫生，2011，27（1）：3.

［10］王桂峰，王晓红，尹国武，等.miR－19a在正常妊娠及重度子痫前期患者胎盘中的表达［J］.现代生物医学进展，2011，11（12）：2335.

［11］曾 辛，王 枫，黄齐香，等.重度子痫前期患者胎盘组织中miR－21的表达及其临床意义［J］.中国妇幼保健，2012，27：2184.

［12］Enquobahrie DA，Abetuw DF.Placental microRNA expression in pregnancies complicated by preeclampsia［J］.Am J Obstet Gynecal，2011，204（2）：178.

［13］Zhang Y，Fei M，Xue G，et al.Elevated levels of hypoxia－inducible microRNA－210in preeclampsia：new insights into molecular mechanisms or the disease［J］.Cell Mol Med，2012，16（2）：249.

［14］De Vito P.Atrial natriuretic peptide：an old hormone or a new cytokine［J］？Elsevier，2014，58：108.

［15］Teran E.Plasma and palcental nitric oxide levels in women with and without pre－eclampsia living at different altitudes［J］.Int J Gynaecol Obstet，2009，104（2）：140.

［16］孙 波，郑桂琴，赵卫华，等.子痫前期外周血免疫相关基因的差异表达［J］.浙江临床医学，2009，11（6）：570.

［17］Tycko B.Imprinted genes in placental growth and obstetric disorders［J］.Cytogenet Genome Res，2006，113（1－4）：271.

［18］Gao WL，Liu M，Yang Y，et al.The imprinted H19gene regulates human placental trophoblast cell proliferation via encoding miR－675that targets Nodal Modulator 1（NOMO1）［J］.RNA Biol，2012，9（7）：1002.

［19］Tunster SJ，Jensen AB，John RM.Imprinted genes in mouse placental development and the regulation of fetal energy stores［J］.Reproduction，2013，145（5）：R117

［20］Liang XY，Chen X，Jin YZ，et al.Expression and significance of the imprinted gene PEG10in placenta of patients with preeclampsia［J］.Genet Mol Res，2014，18，13（4）：10607

［21］沈彦婷，于 红.胎儿游离核酸与子痫前期的研究进展［J］.国际妇产科学杂志，2012，29（6）：553

［22］Winger EE，Reed JL，Ji X.First－trimester maternal cell microRNA is a superior pregnancy marker to immunological testing for predicting adverse pregnancy outcome［J］.J Reprod Immunol，2015，110：22.

Study on differential expression of miRNA in placental tissue from severe preeclampsia and normal maternal

JIANG Tao－tao，SUN Bo，SHEN Mei，et al.
（The Second People＇s Hospital of Shenzhen，Anhui Medical University，Shenzhen518035，China）

ObjectiveTo detect differential expression of small RNA（miRNA）in placental tissue from severe pre－eclampsia and normal maternal，and to explore the pathogenesis of severe preeclampsia.Methods We chose 5cases of severe preeclampsia patients（experimental group）and 5cases of normal pregnancy pregnant women（control group）among those delivery in hospital.And the miRNA expression profile was studied using miRNA microarray analysis.Results Eighty－one miRNAs were found to be dysregulated in placentas of sPE patients among the 391identified genes.Eighty miRNAs were overexpressed and only one miRNA was underexpressed.These differential expression of miRNA may be related to cell differentiation，vascular remodeling，endocrine regulation，and so on.Conclusion The dysregulation of miRNA in severe preeclamptic placental tissue is closely associated with the the pathophysiological process of sPE.

Severe preeclampsia；Placenta；miRNA；differential expression

R714.2

A

2015－01－12）

1007－4287（2015）10－1707－04

深圳市科技计划项目（JCYJ20130401113027619）

＊通讯作者