EB病毒血清学及DNA联合检测在婴幼儿传染性单核细胞增多症临床应用研究

孙志惠，刘 鹏

（天津市第五中心医院1.儿内科；2.检验科，天津300450）

EB病毒血清学及DNA联合检测在婴幼儿传染性单核细胞增多症临床应用研究

孙志惠1，刘 鹏2

（天津市第五中心医院1.儿内科；2.检验科，天津300450）

目的探讨实时定量PCR技术对传染性单核细胞增多症婴儿的诊断价值。方法 选取临床表现为发热的婴儿442例，其中48例传染性单核细胞增多症患儿为观察组，另选择50例健康儿童为对照组，应用实时定量PCR技术（RT－qPCR）检测外周血EB病毒DNA载体，对患儿进行外周血异型淋巴细胞及血清嗜异凝集反应，并对单个细胞EBV－DNA载量进行检测，全面对比分析EBV－DNA诊断的诊断效果。结果 ①EBV－DNA阳性患儿中异型淋巴细胞＞10%患儿39例，占69.6%，血清嗜异凝集反应阳性患儿37例，占66.1%；EBV－DNA阴性患儿中异型淋巴细胞＞10%患者9例，占2.3%，血清嗜异凝集反应阳性患者7例，占1.8%，两组患者异型淋巴细胞＞10%患者及血清嗜异凝集反应阳性患者占比例差异有统计学意义（P＜0.01）；②VCA－IgM阳性率最高，阳性率为87.5%（43／48），明显高于对照组（P＜0.01）。结论 VCA－IgM与DNA联合检测能提高婴幼儿传染性单核细胞增多症诊断准确性。

单核细胞增多症；实时定量PCR技术；异型淋巴细胞；载量

（Chin J Lab Diagn，2015，19：1696）

传染性单核细胞增多症（IM）是一种由EB病毒引起的急性、亚急性单核－巨噬细胞急性增多性疾病［1］。该疾病好发于儿童，特别是婴幼儿，临床表现为发热、淋巴结肿大、咽峡炎以及肝脾肿大，并伴有血液中异常的淋巴细胞增高。由于此疾病临床表现缺乏特异性，加之许多婴幼儿往往只表现为上呼吸道感染症状，故往往容易误诊［2］。目前临床上对此类病患诊断主要靠实验室手段对疑似传染性单核细胞增多症的婴幼儿外周血进行EB病毒感染血清学检查，但是由于婴幼儿身体免疫系统发育尚未完善，此单一方式同样也会造成漏诊。本研究选取EB病毒血清学及DNA联合检测手段，以探讨其诊断效果，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 纳入标准：符合中华医学会关于发热、传染性单核细胞增多症的诊断标准［3］；年龄≤3岁；此前未经药物治疗；排除恶性肿瘤、先天畸形、严重脏器功能不全者；排除临床资料不完整及不能配合研究者。

选取2012.7－2014.7在我院进行住院治疗的发热患儿442例，包括男241例，女201例，年龄3个月－3岁，平均（14.7±8.2）个月。其中经临床及实验室诊断最终确诊为传染性单核细胞增多症患儿48例，占10.9%，包括男26例，女22例，年龄3个月－2.5岁，平均年龄（14.2±7.8）个月。其余诊断为：上呼吸道感染212例，占48%；（支气管炎）肺炎107例，占24.2%；（肺炎）支气管炎65例，占14.7%，其他共10例，包括支原体感染5例，肾小球肾炎3例，病毒性心肌炎2例。

另选取健康查体患儿50例作为对照组，其中男26例，女24例，年龄3个月－3岁，平均（15.2±8.7）个月。两组患者性别、年龄差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

本研究经院伦理委员会批准，并均签署知情同意书。

1.2 检测方法 EBV－DNA载量检测选取实时定量PCR技术（RT－qPCR），具体操作为：先抽取患儿静脉血3ml置于枸橼酸钠抗凝管中，应用TaqMan荧光标记探针基因扩增技术进行检测，探针序列为FPEBV5’－XC－CTCGGA－CAGCTCCTAAGAAGGCACC－Y－3’，26bp。引物序列为：PQEBVF5’－AAGCCCAA－CACTCCAC－CAC－3’，19bp；PQEBVR5’－CTGGTAGGACT－GGGCGAC－3’，18bp。PCR扩增条件：将各反应管放入PE5700PCR仪，按下列条件扩增：在93℃环境下进行预变性2min后，再在93℃环境变性45s后转入55℃环境下变性60s，往复10个循环，最后在93℃环境变性30s后转入55℃下变性45s，往复30个循环。试剂购自中山大学达安基因股份有限公司，具体操作按说明书进行。异常淋巴细胞比率指标检测采用患儿手指血，用推片进行端氏染色，在高倍显微镜下计数异常淋巴细胞；血清嗜异凝集反应采取静脉血2ml置于收集管中，采用嗜异性凝集试剂盒（美国ARLINGTONSCIENTIFIC，INC生产，产品编号：950－0423－00）进行血清嗜异凝集反应检测，以1：160为界限定义阳性和阴性。

1.3 统计学方法 应用SPSS19.0统计软件包进行统计分析，数值采用率或者百分比表示，率比较采用χ2检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 EBV－DNA阳性患儿与阴性患儿异型淋巴细胞与血清嗜异凝集反应比较 EBV－DNA阳性患儿56例，其中异型淋巴细胞＞10%患儿39例，占69.6%，血清嗜异凝集反应阳性患儿37例，占66.1%；EBV－DNA阴性患儿386例，其中异型淋巴细胞＞10%患者9例，占2.3%，血清嗜异凝集反应阳性患者7例，占1.8%，两组患者异型淋巴细胞＞10%患者及血清嗜异凝集反应阳性患者占比例差异有统计学意义（P＜0.01）。表1。

表1 EBV－DNA阳性患儿与阴性患儿异型淋巴细胞与血清嗜异凝集反应对比（例，%）

2.2 EBV四种抗体检测结果 对抗EBV壳抗原抗体（VCA－IgM，VCA－IgG），抗EBV早期抗原抗体（EA－IgG）及抗EBV核抗原抗体（EBNA－I－IgG）检测发现：VCA－IgM阳性率最高，阳性率为87.5%（43／48），明显高于对照组（P＜0.01）。表2。

表2 两组患者EBV四种抗体检测结果对比（例）

3 讨论

婴幼儿传染性单核细胞增多症最常见的临床症状为发热，而引起患儿发热的原因很多，最常见的多为病毒、细菌感染，故对传染性单核细胞增多症的诊断带来极大的干扰［4］。除了典型的发热、咽峡炎、颈部淋巴结肿大及肝脾大外，实验室检查对传染性单核细胞增多症的诊断十分重要。通常原发性EB病毒感染后患者VCA－IgM、VCA－IgG呈阳性，EBVNA－IgG呈阴性。研究显示［5］，VCA－IgM对EB病毒感染具有诊断特异性，因此可作为EB病毒感染诊断依据。但也有研究显示［6］，由于婴幼儿体液免疫功能发育不完善，故上述指标体内水平较低，不易检出。而利用EBV与DNA联合检测则可以避免单一检测EBV受体液免疫功能影响的弊端，使检测更加精准［7］。本研究显示，EBV－DNA阳性的56例患儿中，异型淋巴细胞＞10%患儿39例，占69.6%，血清嗜异凝集反应阳性患儿37例，占66.1%；EBV－DNA阴性患儿386例中，异型淋巴细胞＞10%患者9例，占2.3%，血清嗜异凝集反应阳性患者7例，占1.8%，阳性患者中异常淋巴细胞及血清嗜异凝集反应阳性患儿占比例明显高于阴性患儿，说明EBV－DNA检测准确性较高，能够作为临床EBV诊断依据。

患儿感染EB病毒后，体内首先形成的抗体为抗EBV壳抗原IgM抗体，然后是IgG类抗体。研究发现［8］，在EB病毒感染的早期，患者体内便可出现VCA－IgM，并在体内迅速升高，然后逐渐下降；EA－IgG和VCA－IgG通常也在病毒感染时便出现，但是其在体内增长较VCA－IgM缓慢，通常要在3－5周才会达到高峰［9］；EBNA－IgG出现较为缓慢，通常在VCA－IgG和VCA－IgG高峰过后才会出现，但是其能够在体内保持终身不消失。一般来说对EBNA－IgG的检测最具有代表意义，但是由于其出现缓慢，临床上往往在感染早期只检测VCA－IgM作为诊断依据［10］。本研究对四种抗体进行检测发现，VCA－IgM阳性率最高，达到87.5%，且明显高于正常对照组，分析原因可能与检测时机有关。一般患儿在出现发热时候便立即到医院进行，此时正值VCAIgM高峰，故检测出VCA－IgM阳性较多。但是仅仅检测VCA－IgM不足以做为诊断EB感染的依据，因为有研究发现，部分免疫力低下的患儿抗体检测可为阴性［11］。另外，一些别的病毒例如巨细胞病毒、微小病毒以及弓形虫感染等，同样会出现VCA－IgM升高的情况。故应当对疑似患儿应用VCA－IgM与EBV－DNA联合联测，从而提高诊断敏感性，减少不必要的误诊、漏诊发生。

综上所述，EB病毒血清学及DNA联合检测能够提高婴幼儿传染性单核细胞增多症诊断准确性，值得临床推广应用。

［1］Xiong G，Zhang B，Huang MY，et al.Epstein－Barr virus（EBV）infection in Chinese children：a retrospective study of age－specific prevalence［J］.PLoS One，2014，9（6）：e99857.

［2］Jiao F，Yan X，Yan X，et al.Clinical analysis of 102cases of Epstein－Barr virus infections in Chinese children［J］.Georgian Med News，2014，5（230）：35.

［3］谢正德.儿童EB病毒传染性单核细胞增多症临床特征及诊断标准［J］.实用儿科临床杂志，2007，22（22）：1759.

［4］Liu YL，Ai UH，Yan J，et al.Characterization of BZLF1gene and its promoter Zp of EBV strains in children with EBV－associated diseases in recent 5years in Beijing area［J］.Bing Du Xue Bao，2014，30（1）：6.

［5］Hatton OL，Harris－Arnold A，Schaffert S，et al.The interplay between Epstein－Barr virus and B lymphocytes：implications for infection，immunity，and disease［J］.Immunol Res，2014，58（2－3）：268.

［6］廖楚舒，曹友德，叶剑荣，等.EBV DNA定量检测对儿童传染性单核细增多症早期诊断的临床意义［J］.实用预防医学，2014，21（8）：991.

［7］谢正德.儿童EB病毒传染性单核细胞增多症临床分析［J］.重庆医学，2012，41（13）：1330.

［8］Sulik A，Oldak E，Kroten A，et al.Epstein－Barr virus effect on frequency of functionally distinct T cell subsets in children with infectious mononucleosis［J］.Adv Med Sci，2014，59（2）：227.

［9］Kurtasova LM，Tolstikova AE，Savchenko AA.Immunologic indexes，enzyme status of lymphocytes and functional activity of blood neutrophils in children withinfectious mononucleosis caused by Epstein－Barr virus［J］.Vestn Ross Akad Med Nauk，2013，12（7）：42.

［10］严海燕，罗晓红，陈娟，等.EB病毒抗体和DNA联合检测可提高儿童传染性单核细胞增多症的诊断灵敏度［J］.中国微生态学杂志，2011，23（6）：540.

［11］Guerrero－Ramos A，Patel M，Kadakia K，et al.Performance of the architect EBV antibody panel for determination of Epstein－Barr virus infection stage in immunocompetent adolescents and young adults with clinical suspicion of infectious mononucleosis［J］.Clin Vaccine Immunol，2014，21（6）：817.

Clinical application study of EB virus serology and DNA combined detection in infants with infectious mononucleosis

SUN Zhi－hui，LIU Peng.
（1 Pediatrics Department；2 Laboratories，the Fifth Center Hospital of Tianjin City，Tianjin300450，China）

ObjectiveTo investigate the value of virus serology and DNA combined detection in infants with infectious mononucleosis.Methods 442cases baby with fever were selected，Among the 48cases of infectious mononucleosis in children as the observation group，Another 50healthy children as control group，Application of real time quantitative PCR（RT－qPCR）EB in peripheral blood virus DNA detection technology of external carrier，The children were given peripheral blood heterotypic lymphocyte and serum heterophile agglutination reaction，And on the single cell EBVDNA load testing，comprehensive comparative analysis of diagnostic effects of EBV－DNA diagnosis.Results The EBVDNA positive patients were atypical lymphocyte in 39＞10%patients，accounted for 69.6%，Serum heterophile agglutination reaction was positive in 37cases，accounted for 66.1%；EBV－DNA negative children with atypical lymphocyte in 9patients with＞10%，accounted for 2.3%，7patients with positive serum eosinophil ISO agglutination reaction，accounted for 1.8%，there were statistical significance between patients with atypical lymphocytes in patients with＞10% and serum eosinophil percentage patients with positive abnormal agglutination reaction in two groups（P＜0.01）；The highest positive rate of VCA－IgM，The positive rate was 87.5%（43／48），Significantly higher than control group（P＜0.01）.Conclusion The combined detection of VCA－IgM and DNA can improve the diagnostic accuracy of infant infectious mononucleosis.

mononucleosis；real－time quantitative PCR；atypical lymphocytes；load

R512.7

A

孙志惠（1975－），女，本科，主治医师，研究方向：儿科感染性疾病。

2014－12－05）

1007－4287（2015）10－1696－03