系统性红斑狼疮患者外周血CXCL13及其受体CXCR5表达水平的研究

谢闻悦，聂李平，杨媛慧

（北京大学深圳医院检验科，广东深圳518036）

系统性红斑狼疮患者外周血CXCL13及其受体CXCR5表达水平的研究

谢闻悦，聂李平，杨媛慧

（北京大学深圳医院检验科，广东深圳518036）

目的检测系统性红斑狼疮（SLE）患者血清趋化因子CXCL13水平及其受体CXCR5在外周血B细胞、滤泡辅助T细胞（TFH）上的表达，分析CXCL13、TFH细胞水平与疾病活动的相关性，探讨CXCL13及CXCR5受体在SLE发病机制中的可能作用。方法 酶联免疫吸附法（ELISA）检测58例SLE患者血浆CXCL13水平，以流式细胞术检测24例SLE患者外周血中CXCR5在CD19＋B细胞、TFH细胞上的表达水平。结果 ①血清CXCL13SLE患者组为365.96±216.02（pg／ml），高于健康对照组145.66±207.25（pg／ml）（P＜0.01）与SLE缓解组167.19±145.37（pg／ml）；CXCL13水平与SLE患者的SLEDAI评分、抗核抗体滴度呈正相关（P＜0.05）。②SLE患者B细胞CXCR5的表达率为79.03±20.59%，显著低于健康对照组94.25±4.52%，P＜0.05。③：SLE活动组TFH细胞水平（%）15.36±7.01高于健康对照组8.92±5.11%，P＜0.05；TFH细胞水平与患者的SLEDAI评分呈正相关（P＜0.05），与C3、dsDNA无相关性（均P＞0.05）。结论 SLE患者外周血CXCL13及表达其受体CXCR5的TFH细胞水平增高，并与病情的活动性相关，提示CXCL13有可能积极参与至SLE的发病机制中，并更有可能为SLE的治疗提供新的靶点。

红斑狼疮；系统性；趋化因子CXCL13；受体CXCR5

（Chin J Lab Diagn，2015，19：1689）

系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）是自身免疫病的原型，发病机制尚不明确，高度活化的T、B淋巴细胞被认为是其主要的免疫特征之一。CXCL13又名B淋巴细胞趋化因子，属于CXC趋化因子家族，与其受体CXCR5一同在B淋巴细胞迁移、寻靶和诱导次级淋巴组织中生发中心的形成中有着重要作用［1］。研究显示，CXCR5不仅表达于B细胞表面，还是滤泡辅助T细胞（TFH）表面的重要标志。这决定了TFH细胞的定位和功能，在淋巴滤泡中CXCL13的趋化下，被募集到淋巴滤泡并与B细胞共定位且辅助B细胞的增殖与活化，促进Ig同型转换和浆细胞分化［2，3］。本文通过测定SLE患者血清CXCL13及其CXCR5在外周血B细胞、TFH细胞上的表达水平，探讨CXCL13及其受体CXCR5在SLE发病机制中的作用。

1 材料与方法

1.1 研究对象

1.1.1 血清CXCL13检测的研究对象 收集2011年11月至2012年10月于我院风湿免疫科住院SLE患者58例，所有患者均符合1982年美国风湿病学院（ACR）修订的SLE诊断标准。按SLE疾病活动指数（SLEDAI）分为活动组（≥5分）和稳定组（＜5分）。活动组23例，男性1例，女性22例，平均（30±7）岁；缓解组35例，男性3例，女性32例，平均年龄（33±10）岁。健康对照组22例，男性3例，女性19例，平均（26±5）岁，无自身免疫性疾病史。

1.1.2 外周血细胞CXCR5表达的研究对象 选取2011年11月至2012年5月于我院风湿免疫科住院SLE患者24例，男2例，女22例，平均年龄（30±13）岁。所有患者均符合1982年美国风湿病学院（ACR）修订的SLE诊断标准。健康对照组15例，男4例，女11例，平均年龄（31±12）岁，无自身免疫性疾病史。检测外周血CD4＋CXCR5＋T细胞（TFH）水平以及CXCR5＋在B细胞（CD19＋）上的表达。

1.2 主要仪器和试剂 FITC－CD4单抗、ECD－CD3单抗和ECD－CD19单抗购自美国Beckman公司，PE－CXCR5单抗购自美国R＆D公司，流式细胞仪型号为美国Beckman公司EPICS XL－4。CXCL13水平检测试剂盒购自美国R＆D公司。抗核抗体（ANA）检测试剂盒、双链DN A（dsDNA）抗体试剂盒为欧蒙医学实验诊断股份公司产品；、补体C3试剂与仪器均为美国Beckman公司生产。

1.3 方法

1.3.1 流式细胞术检测TFH细胞、B细胞表面CXCR5表达水平 取EDTA抗凝外周血标本50 μl 3管，分别加入阴性对照抗体、CD5－FITC／CXCR5－PE／CD19－ECD抗体和CD4－FITC／CXCR5－PE／CD3－ECD抗体，每种抗体各加10μl。4℃避光孵育30min后，加入250μl溶血剂室温放置10 min，鞘液离心洗涤去上清后，500μl鞘液重悬，用流式细胞仪按常规操作进行检测，所得数据用其配套软件分析。

1.3.2 CXCL13、dsDNA水平检测采用酶联免疫吸附试验（ELISA），具体操作严格按照试剂盒说明书进行。

1.3.3 ANA检测采用间接荧光免疫法，具体操作严格按照试剂盒说明书进行，结果判断为显微镜下观察荧光模型及滴度，以滴度大于或者等于1∶100为ANA检测阳性。补体C3采用透射比浊法检测。

1.4 统计学处理 数据采用SPSS19.0统计软件进行分析，计数资料以百分率（%）表示，计量资料以均数±标准差（x—±s）表示，两组间的比较采用独立样本t检验，相关性分析采用Spearman相关分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CXCL13的水平及CXCL13与实验室指标间的相关性 SLE患者活动组CXCL13水平为365.96±216.02（pg／ml），高于健康对照组145.66 ±207.25（pg／ml）（P＜0.01）；SLE稳定组CXCL13水平为167.19±145.37（pg／ml），与健康对照组相比差异无统计学意义（P＞0.05）见图1。进一步分析SLE患者血清CXCL13水平，发现11（19%）例狼疮肾炎患者的CXCL13水平为329.8±236.1（pg／ml），高于47例非狼疮肾炎患者201.98± 172.03（pg／ml）；对58例SLE患者CXCL13水平患者的SLEDA I评分、抗核抗体（ANA）、双链DNA抗体（dsDNA）、补体C3水平的相关性进行统计学分析。结果表明，CXCL13水平与患者的SLEDAI评分、抗核抗体滴度呈正相关（P＜0.05），与C3、dsDAN无相关性（均P＞0.05），见表1。

表1 CXCL13与SLEDAI、dsDAN、ANA、C3的相关性

2.2 CXCR5在外周血TFH细胞、B细胞上的表达2.2.1 CXCR5在B细胞上的表达 SLE患者B细胞CXCR5的表达率（%）为79.03±20.59，显著低于健康对照组B细胞CXCR5的表达率94.25± 4.52，P＜0.05，结果见图2。

2.2.2 外周血CD4＋CXCR5＋T细胞（TFH）的水平 SLE患者组TFH细胞水平（%）15.36±7.01，健康对照组为8.92±5.11，P＜0.05（见图3）；TFH与患者的SLEDA I评分呈正相关（P＜0.05），与C3、dsDNA无相关性（均P＞0.05），见表2。

图1 SLE组与正常对照组间CXCL13的比较（SLE活动组与正常对照组，P＜0.05）

图2 SLE组与正常对照组间B细胞上CXCR5的表达（SLE组与正常对照组，P＜0.05）

图3 外周血SLE组与正常对照组间TFH细胞水平的比较（SLE组与正常对照组，P＜0.05）

表2 TFH细胞水平与SLEDAI、dsDAN、C3的相关性

3 讨论

系统性红斑狼疮（SLE）发病机制复杂，为多种因素相互作用，导致免疫紊乱，B细胞异常被认为是SLE发病的中心环节，可能参与狼疮疾病的整个过程，导致疾病的发生［4］。趋化因子CXCL13在吸引B细胞迁移，有效诱导外周器官二级淋巴组织的形成中起着重要作用［1，5］。在多个以B细胞异常增生与活化为特征的疾病研究中发现的CXCL13升高与疾病的活动性相关，推测CXCL13可能与疾病的发病机理相关［6，7］。Ishikawa等是最早将SLE与CXCL13联系一起的，他们发现高龄狼疮肾炎BWF1小鼠的胸腺和肾脏中的CXCL13表达显著增加，认为CXCL13可诱导受损器官中异位淋巴组织的形成以及炎性细胞的聚集［8］。本研究显示SLE活动组病人的CXCL13明显高于健康组与SLE稳定组，并与疾病活动指数SLEDAI呈正相关，这与Schiffer和Ezzat等人结果相一致［9，10］，说明CXCL13与SLE的疾病活动相关，可作为SLE疾病活动期的稳定标志。然而Schiffer等人发现CXCL13在炎症反应尤其是败血症中会显著升高，故而提示CXCL13不能用于区分重度的炎症反应和自身免疫病活动期［11］。狼疮肾炎（LN）是SLE常见而严重的并发症，肾内B细胞的增殖和聚集导致肾脏的炎症与疾病的进展，而B细胞的聚集区域可出现CXCL13水平的升高和CXCL13mRNA表达的增强［12］。Ezzat等人报道LN患儿血清CXCL13水平较无肾脏疾病的SLE患儿显著升高，且与肾脏的损害程度相关［10］。进一步分析本研究结果发现，11（19%）例狼疮肾炎患者CXCL13水平远高于非狼疮肾炎患者，这提示CXCL13还有可能成为肾脏损伤程度的指标。Worthmann的研究结果进一步发现，CXCL13表达定位于肾小球，诱导炎性因子的产生，参与肾小球肾炎的发病机理，推测CXCL13作为治疗靶点的可能［12］。

B细胞异常被认为是SLE发病的中心环节，活化的B细胞在T细胞的辅助下产生致病性的自身抗体导致组织损伤，并通过分泌细胞因子参与免疫调节，使自身免疫状态持续存在。CXCR5作为趋化因子CXCL13的特异性受体，主要分布在所有的外周成熟B细胞表面。我们的结果显示，SLE病人组B细胞上的CXCR5表达明显低于健康组，这可能与SLE患者CXCL13水平显著升高，持续性诱导外周血表达CXCR5＋B细胞归巢进入淋巴滤泡，进而导致B细胞上CXCR5的表达下降相关［13］。Maiko等人推测，丢失CXCR5的病理性B细胞借助滤泡辅助T细胞（TFH）的介导产生病理性自身抗体，获得记忆B细胞的效应功能参与到SLE的疾病进程中［14］。

TFH是目前研究的热点之一，也是最主要的效应辅助T细胞，主要定位于淋巴器官中的滤泡区。其表面除标志性表达趋化因子受体CXCR5，还表达BCL－6，PD－1，ICOS等表面分子。主要功能是在CXCL13的诱导下迁移进入生发中心与B细胞接触，辅助进行B细胞选择和协助其分化为记忆细胞和浆细胞，进而参与SLE的发病机制中。多个研究发现SLE患者外周血CD4＋CXCR5＋的TFH细胞比例升高，并与SLEDAI、浆细胞、自身抗体dsDNA等指标显著相关［15，16］。Chio［15］等人认为TFH与疾病的活动性相关表明T－B细间相互作用的异常平衡是参与SLE的发病机理的关键。Xu［16］等人发现CD4＋CXCR5＋T细胞较CD4＋CXCR5－T细胞能帮助B细胞产生更多IgG，以抗CD40L阻断T－B细胞间相互作用可降低抗体的产生。与文献报道相同的是我们也发现SLE患者外周血TFH比例显著高于健康对照组，并SLEDAI评分呈正相关，但与dsDNA等指标无相关性。我们认为SLE是高度异质性疾病，临床表现多种多样，即使是发病年龄不同的患者，临床特征和发病机制也可能存在差异。如果研究中选择SLE患者样本有差异，或者还存在药物治疗、感染等混杂因素的影响，就可能出现研究偏差，继而造成研究结果的差异。

吴凤霞［17］等人报道CXCL13水平与环磷酰胺及羟氯喹等免疫抑制剂用量呈显著性正相关，抗－CXCL13治疗可抑制胶原诱导的关节炎及降低淋巴组织的滤泡反应［18］。俞宁［19］等发现经地塞米松治疗一周后，SLE病人的TFH细胞可逐渐降低，Meraouna［20］发现糖皮质激素可以抑制CXCL13的产生进而影响生发中心B细胞的数量和迁移，减少生发中心的形成，CXCL13有可能为治疗提供新的靶向分子。

综上所述，SLE患者外周血CXCL13及表达其受体CXCR5的TFH细胞水平增高，并与病情的活动性相关，这些都提示CXCL13有可能积极参与至SLE的发病机制中，并更有可能为SLE的治疗提供新的靶点。

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The study of circulating CXCL13level and expression of its receptor CXCR5 with system lupus erythematosus

XIE Wen－yue，NIE Li－ping，YANG Yuan－hui.
（Department of Clinical Laboratory，Peking University Shenzhen Hospital，Shenzhen518036，China）

ObjectiveTo detect the s levels of chemokine CXCL13and the expression of receptor CXCR5on CD19＋B cell and CD4＋Th cells in patients with systemic lupus erythematosus（SLE），to access the relationship between CXCL13、TFH and SLE disease activity.Methods The serum levels of CXCL13were measured by enzyme linked immunosorbent assay（ELISA）in 58patients with SLE and frequencies of CD19＋CXCR5Bcells and CD4CXCR5Tcell w ere analyzed b y flow－cytometry in 24patients with SLE.Results ①Serum CXCL13concentration was significantly higher in SLE active patients than inactive SLE group and NC group（P＜0.05）；Increase in CXCL13concentration correlated positively and significantly with SLEDAI，Anti－nuclear antibody titers（all P＜0.05）.②the frequencies of CXCR5on CD19＋B cell were significantly down regulated in SLE patients whiling comparing with NC group.③The percentage of CXCR5in CD4＋T cells was increased jn patients with SLE compared with healthy controls，P＜0.05.There were positive co－relationship between TFH and SLEDAI.Conclusion Elevated CXCL13level and increased frequency of circulating Tfh cells in SLE patients are associated with disease activity，indicating CXCL13and its receptor CXCR5may play an important role in the pathogenesis of SLE.

Lupus erythematosus；systemic；chemohine CXCL13；receptor CXCR5

R593.2

A

谢闻悦（1974－），女，硕士，主管技师，主要从事临床免疫学工作。

2014－12－05）

1007－4287（2015）10－1689－04

深圳市科技计划项目（201203031）