实验性APS小鼠经口服β2糖蛋白后Th17细胞及RORγt mRNA表达变化

谷文静，熊 斌，谭 岩，方艳秋＊，付 嘉

（1.天津医科大学免疫学教研室，天津300071；2.济宁医学院外科总论教研室，山东济宁272067；3.吉林省人民医院医学诊治实验中心，吉林长春130021；4.济宁医学院基础学院免疫教研室，山东济宁272067）

实验性APS小鼠经口服β2糖蛋白后Th17细胞及RORγt mRNA表达变化

谷文静1，熊 斌2，谭 岩3，方艳秋3＊，付 嘉4

（1.天津医科大学免疫学教研室，天津300071；2.济宁医学院外科总论教研室，山东济宁272067；3.吉林省人民医院医学诊治实验中心，吉林长春130021；4.济宁医学院基础学院免疫教研室，山东济宁272067）

抗磷脂抗体综合征（Antiphospholipid antibody syndrome，APS）是一种系统性的自身免疫性疾病，该病以反复发作的血栓和流产为主要特征和临床表现，患者血清中可检出持续存在抗磷脂抗体（APA）［1］。APS的确切病因目前还不很清楚，除遗传因素和微生物感染参与疾病发生外，大量证据显示，自身反应性T淋巴细胞参与APS的发病，并辅助自身反应性B细胞活化产生抗磷脂抗体（APA），致炎因子TF、TNF－α、IL－6、ET－1等大量生成，内皮细胞和血小板活化，凝血因子和补体激活等，导致APS血栓形成、血管炎症。鉴于致炎因子IL－6在诱导CD4＋细胞向Th17分化中发挥重要作用；激活的补体可通过TLR4信号途径促进Th17的发育；同时来自SLE的Th17分泌的IL－17A可诱导人脐静脉内皮细胞表达ICAM－1等黏附分子，促进SLE血管炎症［2－6］。故而我们推测Th17在APS的发病机制中发挥重要作用。

我们前期工作显示CD4＋CD25＋Treg参与实验性APS（EAPS）的口服耐受机制。本研究采用RT－PCR检测EAPS小鼠PBMC中转录因子RORγt mRNA的表达变化，流式细胞术检测EAPS小鼠PBMC中Th17细胞的百分率；以期进一步了解Th17在EAPS发病机制和口服耐受中所发挥的作用。

1 材料和方法

1.1 主要试剂和仪器 抗小鼠FITC anti－CD4、PE－－anti－IL－17购自美国BD公司及同型对照γ1／γ2购于美国BD公司；离子霉素（Ionomycin）、乙酸肉豆蔻佛波醇（phorbo lm yristic acetate，PMA）及布雷菲德菌素（brefeldin A，BFA）购自Sigma公司。CO2培养箱（GBB16Heraus，German）。流式细胞仪（FACSCalibur，BD公司，美国）；低温高速离心机（Beckman，USA）；RPMI 1640培养液和Hank s＇液购自美国Gibco公司。PCR引物由上海生工生物公司合成。dNTP、Taq DNA聚合酶、TRIZOL、MML－V逆转录酶等购于晶美生物公司。

1.2 实验动物 8－10周龄雌性BALB／c小鼠，购于吉林大学实验动物中心，无特定病原菌条件下饲养。

1.3 人β2糖蛋白1的重组表达 见文献［7］。

1.4 分组 将小鼠分为3组：正常对照组、EAPS模型组及口服耐受组。口服耐受组及EAPS模型组小鼠在模型建立前10天，分别以0.5mg rhβ2GP1／PBS灌胃，隔天灌胃1次共5次。

1.5 免疫方案——EAPS模型的建立及各项指标检测 见文献［8］。

1.6 流式细胞仪检测小鼠PBMC CD4＋IL－17＋Th17细胞 用RPMI1640培养基调整外周血单个核细胞浓度为1×109／L，用24孔板进行培养，每孔加入200μl的细胞悬液，含PMA（25μg／L）、Ionomycin（1mg／L）和BFA（10mg／L），5%CO2，37℃孵育培养5h，间隔30分钟摇匀一次。取出移至试管中，加10μl FITC anti－CD4，室温避光孵育30 min。加100μl固定液孵育15min，PBS洗涤后加100μl破膜液，同时加入PE－－anti－IL－17及同型对照，孵育30min。以含1%多聚甲醛的PBS避光固定，待上机检测。在FSC－SSC散点图上圈定淋巴细胞群，用CD4和SSC射门。选择CD4＋细胞分析IL－17的表达，收集细胞数10 000／管进行分析。流式细胞仪检测，使用Cell Quest分析软件进行分析。

1.7 RT－PCR检测小鼠PBMC中RORγt mRNA表达 Trizol试剂提取总mRNA，在42℃进行逆转录。PCR体系中加入2.5UTaqDNA多聚酶，2.5 mM dNTPs，0.25μM引物，引物分别为RORγt（5’－CTGAGGGGCTGTCAAAGTG－3’）和（5’－AAG GCT GGG TGA AGG G－3’），或GAPDH（5’－TCCA CCACC CTG TT GCTGTA－3’）和（5’－ACCACAGTCC ATGCC ATCAC－3’）。94℃40s，56℃60s，72℃60s。94℃90s，72℃7min。共30个循环。扩增产物用2%的琼脂糖凝胶进行电泳，凝胶成像分析。检测产物灰度值与内参的灰度值的比值表示RORγt mRNA的相对表达水平。1.8 统计学方法 数据以“均数±标准差”表示，应用SPSS10.0统计软件进行方差分析，组间比较采用q检验。

2 结果

2.1 小鼠PBMC中CD4＋IL－17＋Th17细胞百分率变化 在三组小鼠免疫后第4、8、12、16、20周检测三组小鼠的Th17细胞在CD4＋T细胞百分率，结果发现，模型组在第4周开始逐渐升高，在第8、12、16周与正常对照组均具有显著差异性（P＜0.05）。耐受组在各时间段与对照组相比，差异未见显著性（P＞0.05）（图1）。

2.2 小鼠PBMC中转录因子RORγt表达的变化三组小鼠免疫后4、8、12、16、20周RORγt mRNA表达变化（如图2），自第4周，模型组小鼠表达水平逐渐升高，第8、12、16、20周差异显著（P＜0.05）；耐受组小鼠PBMC中RORγt基因表达在各时间段明显低于模型组（P＜0.05），与正常对照组无显著性差异（P＞0.05）。

图1 流式细胞术检测口服耐受组、模型组及对照组小鼠PBMC中CD4＋IL－17＋T细胞百分率变化

图2 RT－PCR检测口服耐受组、模型组及对照组小鼠PBMC中RORγt mRNA表达变化

3 讨论

长期以来，很多学者们认为Th1细胞介导了多种自身免疫性疾病的发生。然而，Langrish等研究发现：在基因敲除动物模型中，缺失能产生IL－17的（IL－17＋）T细胞可以使实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的发病受到抑制。Park等研究也发现：清除或中和EAE动物模型的Th1型细胞因子（IFN－γ或IL－12），并不能预防或减轻自身免疫性疾病的发生和进展。从而使人们认识到在此情况下，是IL－17＋T细胞诱导了自身免疫病的发生和进展。因此将这种能分泌IL－17的T淋巴细胞命名为一个新的亚群——Th17细胞。此后，随着研究的不断深入，越来越多的证据表明Th17细胞与自身免疫性疾病之间存在着密切的关系［9－12］。现已知道，IL－17表面表达IL－6R、IL－21R、CCR6、IL－23R、IL－1R等炎症相关受体，核内表达维甲酸相关的孤儿核受体（RORγt）和STAT3。其中，RORγt是调控Th17细胞分化的关键转录因子，并可诱导IL－17的分泌，也是Th17的特异性标志［13－15］。

研究表明，口服自身抗原可诱导多种实验性自身免疫病的耐受，这可以为特异性治疗自身免疫性疾病提供新的途径和思路。口服耐受的机制涉及免疫无能和缺失、主动抑制、旁路抑制等。通常高剂量抗原可诱导自身反应T细胞的克隆删除和克隆无能，低剂量可诱导主动抑制。我们的前期工作表明，CD4＋CD25＋Treg参与EAPS的发病和口服耐受机制［8］。

Th17与Treg细胞都来源于初始CD4＋T细胞，两者的功能和分化过程密切相关，在正常情况下两者保持平衡［16］。当机体发生炎症反应、自身免疫性疾病时，初始T细胞的分化格局发生变化，Th17细胞分化增强，导致一系列炎症反应损伤机体。研究发现在多发性硬化症（MS）、类风湿性关节炎（RA）、重症肌无力（MG）、系统性红斑狼疮（SLE）等自身免疫病患者及动物模型中均存在Th17数量和功能的改变［9－11，17］。故而我们推测Th17细胞在APS发病机制和口服耐受中发挥作用。

本研究表明，自免疫第4周，自身反应性T、B淋巴细胞增殖活化，模型组小鼠PBMC中CD4＋IL－17＋Th17细胞开始升高，随着疾病进展，CD4＋IL－17＋Th17细胞频率继续升高（P＜0.05），提示自身免疫反应产生的大量致炎因子如TNF－α［3］、IL－6［6］等可能促进了Th17细胞的分化。而耐受组在各时间段与对照组相比未见显著差异（P＞0.05），显示口服耐受可能对Th17细胞的发生、分化或分布产生影响。随着CD4＋IL－17＋Th17细胞频率升高，模型组小鼠PBMC中转录因子RORγt mRNA表达水平也相应升高（P＜0.05），耐受组小鼠PBMC中RORγt基因表达在各时间段均明显低于模型组（P＜0.05），与正常对照组相比差异无显著性（P＞0.05）。鉴于RORγt是调控Th17分化的关键转录因子，我们的研究结果提示APS进展与Th17的过度分化有密切关系；口服耐受可通过调节Th17的分化发挥作用。

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谷文静（1982－），女，在读硕士，主要从事免疫学、分子生物学方面的研究。

2014－08－16）

1007－4287（2015）10－1639－03

山东省自然科学基金项目资助课题（ZR2010CL017、ZR2014HL023）；济宁市科技局项目资助课题；济宁医学院重点科研项目资助课题

＊通讯作者