响应面法优化脉冲强光对巴氏奶霉菌的灭菌工艺
2015-05-05朱力杰惠丽娟
王 勃,朱力杰,惠丽娟,刘 贺,马 涛
(渤海大学化学化工与食品安全学院,渤海大学粮油科学与技术研究所,辽宁锦州 121013)
响应面法优化脉冲强光对巴氏奶霉菌的灭菌工艺
王 勃,朱力杰,惠丽娟,刘 贺,马 涛*
(渤海大学化学化工与食品安全学院,渤海大学粮油科学与技术研究所,辽宁锦州 121013)
为研究脉冲强光杀菌技术对巴氏奶杀菌的效果,以巴氏奶为研究对象,用霉菌灭菌率作为衡量脉冲强光灭菌技术的指标。在单因素实验基础上,选取闪照次数、闪照距离、闪照能量和样液厚度为自变量,霉菌灭菌率为响应值,利用Box-Benhnken中心组合设计原理和响应面分析法,确定最佳条件为闪照次数35次、闪照距离12.8cm、闪照能量300J、样液厚度2mm。在此条件下,霉菌灭菌率达到99.97%。借助电子鼻测定分析,通过线性判别分析法(LDA)进行气味信息的分析和判断,利用Alphasoft分析软件对奶样进行货架期预测,得到空白样和对照样的预测货架期天数分别是5d和7d,说明脉冲强光灭菌技术可以有效延长巴氏奶的货架期。
巴氏奶,灭菌,货架期,电子鼻,脉冲强光
牛奶在生产加工及贮藏过程中存在很多安全隐患,由于微生物的污染导致牛奶快速腐败变质、货架期缩短、乳及乳制品品质下降等诸多问题一直困扰着人们。基于目前牛奶保鲜技术存在种种不足,诸如超高压杀菌技术、臭氧灭菌技术、紫外线消毒技术等冷灭菌技术倍受关注,其灭菌温度低,既利于保持食品中功能成分的生理活性,又有利于保持其色、香、味及营养成分。
脉冲强光技术是近年来逐步发展起来的一种新型非热灭菌技术[1],该技术作为表面灭菌具有强度高、耗能低、瞬时性等特点能够破坏多种微生物,广泛应用于水处理、空气灭菌、食品加工、制药、乳制品等众多领域,避免了传统热灭菌对热敏性活性物质的破坏和化学灭菌带来的食品安全隐患[2-3]。目前还没有相关文献关于脉冲强光对巴氏奶霉菌灭菌效果的研究,本实验研究脉冲强光对巴氏奶霉菌的灭菌效果,为有效控制鲜牛奶加工及产品储藏过程中霉菌污染,提高产品品质提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
巴氏奶 沈阳辉山乳业有限公司;孟加拉红培养基 北京奥博星生物有限公司。
AR224CN电子天平 奥豪斯仪器(上海)有限公司;BPS-100CA恒温生化培养箱 上海一恒科学仪器有限公司;EC2菌落计数分析仪 法国生物梅里埃集团;HH-6数显恒温水浴锅 金坛市鑫鑫实验仪器厂;MiniMix400W拍打均质器 法国Interscience公司;Pen3电子鼻 德国Airsense公司;SW-CJ-2FD超净工作台 苏州安泰空气技术有限公司;YXQ-LS-75S11立式全自动压力灭菌锅 北京科创百万科技发展有限公司;ZWB-I-01(LA50-800A)脉冲强光灭菌实验柜 宁波中物光电灭菌技术有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 巴氏奶处理方法 分别吸取5、10、15、20、25mL的巴氏奶待测液于五个无菌培养皿中,用倾倒法对巴氏奶样品进行处理。
1.2.2 脉冲强光闪照处理 实验参数设定为:(1)闪照距离13cm、闪照能量300J、样液厚度2mm的相同条件下,闪照次数为:10、20、30、40、50 次;(2)在闪照次数30 次、闪照能量300J、样液厚度2mm的相同条件下,闪照距离为:12、13、14、15、16cm;(3)在闪照次数30次、闪照距离13cm、样液厚度2mm的相同条件下,闪照能量为:100、200、300、400、500J;(4)在闪照次数30次、闪照距离13cm、闪照能量300J的相同条件下,样液厚度为:1、2、3、4、5mm。设计以闪照能量、闪照距离、闪照次数、样液厚度为四个单因素的实验,研究脉冲强光对处理的巴氏奶的霉菌灭菌效果的影响。
1.2.3 微生物检验 将脉冲强光处理前和处理后的两种不同样品,参照GB 4789.15-2010《食品微生物检验 霉菌和酵母计数》[4],用菌落计数仪计算霉菌菌落数,做两次重复取平均值。霉菌灭菌率的计算公式:
灭菌率(%)=[(初始菌落数-处理菌落数)/初始菌落数]×100
1.2.4 优化实验条件和验证 选择闪照能量(J)、闪照距离(cm)、闪照次数(次)和样液厚度(mm)四个单因素的实验结果,分别用A、B、C、D表示,以巴氏奶霉菌的灭菌率(%)为响应值(Y)[5-7],以上述四个单因素为自变量设计响应面实验设计。根据Box-Behnken中心组合设计原理,利用Design Expert 8.0.6软件分析数据,筛选脉冲强光对巴氏奶霉菌灭菌效果的最佳实验条件,设计响应面实验三水平四因素表如表1所示。
1.2.5 电子鼻测定方法 分别将经过脉冲强光处理对照样和未经脉冲强光处理空白样各20mL奶样置于50mL烧杯中用保鲜膜封口,在常温下放置20min。待样品挥发性物质挥发达到平衡后,采用顶空抽样的方法对其进行测量,每个样品平行测定3次。
表1 响应面实验因素水平编码表Table 1 Factors and levels of response surface experiments
电子鼻测定参数:进气量360mL/min,检测时间为40s,清洗时间为90s[8]。电子鼻系统自动记录样品的处理数据,保存后重新换上保鲜膜于冰箱内保存,每隔24h检测一次,持续8d。
1.2.6 数据处理 采用SAS8.0对实验数据进行线性判别式分析法(Linear Discriminant Analysis,LDA)。LDA是一种常用的模式分类方法,根据统计学原理,假定判别函数Y是样品X的线性函数,每一类样品形成一个判别函数,寻找未知样品在最大判别函数值的类别中的位置[9]。
2 结果与分析
2.1 单因素实验结果与分析
2.1.1 闪照次数对霉菌灭菌率的影响 五种层次照射次数对巴氏奶霉菌的灭菌效果如图1所示。以相同的闪照能量、闪照距离和样液厚度为前提,探究不同闪照次数与霉菌灭菌程度的差异。图1中,霉菌的灭菌率随着闪照次数的增加而逐渐走高,两者正相关。闪照次数在10～20次层次之间,霉菌的灭菌率的增幅坡度较陡。达到30次时,曲线出现了第一个峰值,成为霉菌灭菌率的首个最高值。闪照次数在30次以后霉菌的灭菌率变化不明显,上升幅度缓慢。说明30次的闪照次数能达到明显的灭菌效果,随着相应的闪照次数的增加,脉冲强光设备的损坏程度和能量的损耗也有所增大,最终选择30次为巴氏奶最佳的霉菌灭菌次数。
图1 闪照次数对霉菌灭菌率的影响Fig.1 Influence of flash times on disinfection rate of mould
2.1.2 闪照距离对灭菌率的影响 如图2所示,脉冲强光的闪照距离与霉菌的灭菌率呈负相关,灭菌率随着闪照距离的增加而逐渐减少,江天宝等人[10-11]的研究表明残存的活菌数会随着闪照距离的增大而增加,与本实验研究的结果相同。闪照距离在12cm时灭菌效果最好,而在16cm时灭菌效果最差,最终选择12cm作为最佳。
图2 闪照距离对霉菌灭菌率的影响Fig.2 Influence of flash distance on disinfection rate of mould
2.1.3 闪照能量对灭菌率的影响 图3中,从100J到300J闪照能量范围内,霉菌的灭菌率逐渐增大,由70.98%递增到98.77%,此区间内的灭菌效果持续保持明显状态。闪照能量增长到300J以上时,灭菌效果较为稳定,上升幅度缓慢,说明在300J的能量强度照射下,霉菌细胞受到了很大的破坏。
图3 闪照能量对霉菌灭菌率的影响Fig.3 Influence of flash energy on disinfection rate of mould
2.1.4 样液厚度对灭菌率的影响 图4中,样液厚度与霉菌灭菌率呈负相关,样液厚度增加,灭菌率效果随之降低,1mm处的样液厚度存在最大灭菌率为97.78%。之所以单因素选择样液厚度为2mm而不是1mm为最佳条件是因为两者杀菌效果相差甚微,且样液厚度越大,处理量越大,提高了处理效率。
图4 样液厚度对霉菌灭菌率的影响Fig.4 Influence of liquid sample thickness on disinfection rate of mould
2.2 响应面法灭菌条件的优化
2.2.1 响应面实验设计及结果 采用Design-Expert 8.0.6软件回归分析实验数据,获得回归方程,寻找获得最大灭菌率的二次多项回归方程[12-13]。有关闪照次数(A)、闪照距离(B)、闪照能量(C)及样液厚度(D)四个水平的二次多项回归方程如下:Y=99.80-0.094A+0.086B+0.13C+0.41D+6.13AB+3.82AC-3.73AD+4.06BC-3.11BD+5.81CD-7.85A2-2.72B2-6.24C2-5.99D2。
表2 Box-Behnken 实验设计及结果Table 2 Results of response surface experiments
表3中回归模型极显著(p<0.0001),失拟项不显著(p=0.1372>0.05),模型的失拟项表现为不显著,说明该模型建立的有意义且拟合关系良好。模型相关系数R2=0.9585,表明此回归模型三水平四因素的回归分析合理,四因素与Y之间有良好的线性关系,可替代性好,可用于实验结果的分析,对选取最佳工艺条件的优化预测有很高的可信度[14-16]。在此回归模型中,一次项C和D均达到了极显著水平(p<0.0001),闪照次数A的影响显著(0.01
表3 回归方程方差分析表Table 3 Analysis results of regression and variance
注:**表示差异极显著(p<0.01),*表示显著(0.01 闪照次数(A)、闪照距离(B)、闪照能量(C)和样液厚度(D)对霉菌灭菌率影响大小依次排序为D>C>A>B。二次项A2、B2、C2和D2以及交互项AB、AD、CD显示极显著影响,交互项BD影响显著,而交互项闪照次数A、闪照能量C和闪照距离B、闪照能量C影响不显著,此现象表明实验选定的四种单因素影响因子对霉菌的影响不是单一的线性关系[13]。 2.2.2 各因素之间的交互作用 见图5～图7。 图5 闪照次数和闪照能量对霉菌灭菌率的响应面图Fig.5 Response surface of flash times and flash energy on the disinfection rate of mould 图6 样液厚度和闪照能量对霉菌灭菌率的响应面图Fig.6 Response surface of liquid sample thickness and flash energy on the disinfection rate of mould 图7 样液厚度和闪照次数对霉菌灭菌率的响应面图Fig.7 Response surface of liquid sample thickness and flash times on the disinfection rate of mould 利用二次多项式回归方程一阶偏导,通过Design-Expert 8.0.6软件对回归模型分析,筛选出最佳实验参数:A=35.3,B=12.13,C=280.1,D=2.11。即闪照次数35.3次、闪照距离12.13cm、闪照能量280J、样液厚度2.11mm,但考虑到实际生产条件,乳及乳制品微生物安全标准以及脉冲强光灭菌安全柜装置的设置情况,将此最佳工艺条件修正为:闪照次数35次、闪照距离12.8cm、闪照能量300J、样液厚度2mm。此参数条件下重复3次实验验证,巴氏奶霉菌的灭菌率平均值达到了99.97%,实验值与预测值接近,符合对实验参数的预测,该响应面分析模型可用作脉冲强光对巴氏奶霉菌灭菌条件的优化。 2.3 应用电子鼻对脉冲强光处理前后牛奶货架期的预测 2.3.1 线性判别分析法(LDA) 从图8中可以看出,LDA判别的两个主成分的总贡献率为94.839%,组内信息点非常集中,各个气味特征区分效果好,是因为LDA判别了各类间的差异并将其最大化,更加准确的判断出气味间的差别[17-18]。图8是空白样品第一天货架期的主成分分析图谱,前5d的牛奶气味范围区分明显,说明未经处理的牛奶1～5d的气味特征范围较大。但第6～8d气味图谱有重叠,此空白样的LDA判别结果为第6d开始,空白样的气味特征范围开始模糊,奶样的状态也变得粘稠,颜色略微变黄,说明其气味相似且变化小。在图9中,各个气味特征判别较为明显,两个个判别主成分贡献率分别是91.02%和6.4108%,总和超过了85%,区分效果非常明显。说明6d以后的奶样气味特征范围较为接近,特征值相似,电子鼻不能有效地区分各种气味成分。 图8 空白样的LDA分析图Fig.8 LDA analysis of Blank samples 图9 对照样的LDA分析图Fig.9 LDA analysis of control sample 2.3.2 货架期分析 利用Alphasoft分析软件对经过不同灭菌处理的巴氏奶的气味信息进行货架期分析。相同条件下,以存放时间为横坐标,以不同保存时间的空白样和对照样牛奶检测的传感器响应值相对差值作为纵坐标,绘制气味变化分析曲线。将第一次气味信息作为基准值,若随着保存时间的延长气味强度减弱,则曲线呈下降趋势,分析值为负数,反之则曲线上升,分析值为正数。 从图10可知,随着保存时间的延长,牛奶的气味变化基本呈下降趋势,说明随着牛奶保存天数的延长,传感器对牛奶的气味的捕捉能力逐渐减弱,牛奶的气味强度逐渐降低。在第6d和第8d两者分别达到了气味的突变点,与LDA的分析结果基本一致。因此,脉冲强光对巴氏奶处理前后的货架期分别是5d和7d。 图10 空白样和对照样的分析图Fig.10 Alphasoft analysis chart of blank samples and control samples 本研究通过单因素实验和Box-Behnken中心组合设计原理和响应面分析法对灭菌工艺进行优化,拟合了闪照次数、闪照能量、闪照距离和样液厚度这四个因素对灭菌率的回归模型,经检验证明该模型合理可靠。由该模型确定的最优工艺条件为闪照次数35 次,闪照距离12.8cm,闪照能量300J和样液厚度2mm,霉菌的灭菌率达到99.97%。通过模型系数显著性检验,得到因素的主效应关系为:样液厚度>闪照能量>闪照次数>闪照距离。 利用电子鼻对脉冲强光闪照前后的巴氏奶进行货架期的分析和预测,主要通过线性判别分析法(LDA)对两组奶样进行气味信息的分析和判断,LDA的累积总贡献率为94.839%,说明此方法适用于巴氏奶气味特征的检测分析。利用Alphasoft分析软件对两组奶样进行货架期预测,得到脉冲强光处理前后巴氏奶样品的货架期分别是5d和7d,由此证明脉冲强光灭菌技术可以有效地延长巴氏奶的货架期。 [1]王纯冰,孔庆财,徐伟,等.脉冲强光对流动水中大肠杆菌的杀灭效果研究[J].食品科技,2011,36(4):36-40. [2]张佰清,陈丹.脉冲强光对青霉菌的灭菌实验研究[J].食品科技,2007,3(10):43-45. [3]张佰清,姜树才,刘佳.脉冲强光处理对金黄色葡萄球菌灭菌效果的研究[J].食品科技,2009,34(1):91-93. [4]中华人民共和国卫生部.GB 4789.15-2010食品微生物学检验 霉菌和计数[S].北京:中华人民共和国国家标准.2010 [5]刘昕,马涛,王勃,等.脉冲强光对面包表面霉菌杀菌效果的研究[J].食品科技,2014,39(3):116-120. [6]谈慧芷,马涛,王勃,等.脉冲强光对鲜牛奶细菌杀菌效果的研究[J].食品工业科技,2014,35(3):241-244. [7]唐明礼,王勃,刘贺,等.脉冲强光对煎饼中细菌的杀菌效果的研究[J].食品工业科技2014,35(8):272-275. [8]郭奇慧,白雪,康小红.电子鼻测定牛奶气味过程中测定参数的研究[J].食品工业科技,2007,28(11):226-228. [9]Hemar Y,Tamehana M,Munro P A,et al. Influence of xanthan gum on the formation and stability of sodium casseninate oil-in-water emulsions[J]. Food hydrocolloids,2001,(15):565-574. [10]江天宝,陆蒸,陆则坚,等.脉冲强光对竹笋制品(玉兰片)灭菌效果及品质的影响[J].中国食品学报,2007,7(3):102-106. [11]Mun-Sil Choi,Chan-Ick Cheigh,Eun-Ae Jeong,et al. Nonthermal sterilization of Listeria monocytogenes in infant foods by intense pulsed-light treatment[J].Journal of Food Engineering,2010(97):504-509. [12]Hu J Y,Chu X N,Quek P H,et al. Repair and regrowth of Escherichia coli after low-and medium-pressure ultraviolet disinfection[J].Water Science & Technology:Water Supply,2005,5(5):101-108. [13]M O Buffle,J Schumacher E Salhi. Ozonation and Advanced Oxidation of Waste water:Effect of O3Dose,PH,DOM and HO-Scavengers on Ozone Decomposition and HO-Generation[J].Ozone:Science and Engineering,2006,28(4):247-259. [14]唐明礼,王勃,刘贺,等.响应面优化脉冲强光对煎饼表面大肠杆菌的杀菌效果[J].食品科学,2014,35(16):91-95. [15]王勃,刘昕,马涛,等.响应面法优化脉冲强光对面包表面细菌的杀菌工艺.食品科学,2014,35(18):74-77. [16]王鑫垚,马涛,王勃,等.响应面法优化脉冲强光杀灭干豆腐大肠杆菌条件的研究[J].食品工业科技,2014,35(18):306-309. [17]萝莉,王金水,渠琛玲,等.电子鼻在乳制品中的应用[J].农产品加工学刊,2007(9):9-11. [18]徐亚丹,王俊,赵国军.基于电子鼻的对掺假的“伊利”牛奶的检测[J].中国食品学报,2007,6(5):111-118. Optimization of extraction conditions of pulsed light parameters forenhanced sterilization of mould on pasteurized milkby response surface methodology WANG Bo,ZHU Li-jie,HUI Li-juan,LIU He,MA Tao* (College of Chemistry,Chemical Engineering and Food Safety,Bohai University,Grain andOil Science and Technology Institute of Bohai University,Jinzhou 121013,China) To study the sterilization effect of the pulsed light sterilization technology to the pasteurized milk,pasteurized milk as the research object,with the sterilization rate of mould as a measure indicator. Four extraction parameters including flash times,flash distance,flash energy and samples liquid thickness were optimized using central composite design and response surface methodology based on single factor investigation for achieving maximum the sterilization rate of mould. Using Box-benhnken central composite design and response surface analysis theory,the optimum extraction condition for flash times of 20,flash distance of 12.8cm,flash energy of 300J and samples liquid thickness of 2mm. Under these conditions,the sterilization rate of mould was 99.97%. By means of electronic nose analysis and determination. Odor information of two milk sample were analyzied and judged by linear discriminant analysis(LDA). Using the Alphasoft software,it was found that the shelf life of milk sample were 5d and 7d before and after pulsed light treatment. Plused light sterilization technology can extend the shelf life of pasteurized milk effectively. pasteurized milk;sterilization;shelf life;electronic nose;pulsed light 2014-11-24 王勃(1986-)，男，硕士，实验员，研究方向：粮油工程。 *通讯作者:马涛(1962-)，男，博士，教授，研究方向：粮油工程。 TS252.2 B 1002-0306(2015)13-0252-06 10.13386/j.issn1002-0306.2015.13.045
3 结论
