反相高效液相色谱法同时测定大鼠血清中多索茶碱和甲泼尼龙的质量浓度*

2015-05-02王建美盛柳青裘颖儿

中国药业 2015年9期

陈菲，王建美，盛柳青，裘颖儿

（1.金华职业技术学院医学院，浙江金华 321000； 2.浙江省金华食品药品检验所，浙江金华 321000）

慢性阻塞性肺疾病是老年患者呼吸道的常见病和多发病，患病率和病死率均高，世界卫生组织报告其占全球所有疾病死因的第4位，每年大约有270万人死于该病，我国为128万［1-2］。多索茶碱和甲泼尼龙是临床常用的治疗慢性阻塞性肺疾病发作的药物。多索茶碱是一种具有抗炎和支气管扩张作用的新一代甲基黄嘌呤衍生物，可通过抑制平滑肌细胞内的磷酸二酯酶发挥松弛支气管平滑肌的作用；甲泼尼龙是人工合成的中效糖皮质激素，具有较强的抗炎活性且在肺部的血药浓度较高，能减轻患者急性炎症和气道阻塞；早期联合使用这两种作用机制不同的药物，可有效控制慢性阻塞性肺疾病的各种症状［3-4］。多索茶碱的代谢受多种因素及药物的影响，甲泼尼龙作为激素类药物与多种药物存在相互作用的可能，而两者作为临床常见的联用药物，其药代动力学、相互作用却未见文献报道。本试验中以大鼠为研究对象，针对两者理化性质差异较大的特点，以氢化可的松为内标，采用单一流动相，建立了可同时测定两者血药浓度的反相高效液相色谱（RP-HPLC）法，现报道如下。

1 仪器与试药、动物

Waters2487型高效液相色谱仪（美国Waters公司），2487紫外检测器，Breeze色谱工作站，20μL自动进样阀；WH-90A型微型旋涡混合器（上海振荣科学仪器有限公司）；TDL80-2型离心沉淀器（上海手术器械厂）；1004型电子天平（上海天平仪器厂）；ACS-3型电子计价秤（金华市征龙衡器有限公司）。多索茶碱对照品（批号为100625-201202），甲泼尼龙对照品（批号为100828-200501），氢化可的松对照品（批号为 100152-200206），均由中国药品生物制品检定所提供；水为重蒸馏水，甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯。SD大鼠，清洁级，雄性，体重250～300 g，由浙江省实验动物中心提供，动物试验许可证号为SCXK＜浙＞20140001）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Diamonsil C18柱（150mm ×4.6mm，5 μm）；流动相：甲醇 -0.5% 醋酸溶液（54 ∶46）；检测波长：260 nm；柱温：30 ℃；流速：1.0mL /min；进样量：20 μL；内标物：氢化可的松。

2.2 标准溶液配制

分别精密称取多索茶碱25mg和甲泼尼龙15mg，加甲醇溶解并定容至25mL容量瓶，得含质量浓度为1.0 g/L及0.6 g/L的标准贮备液。精密称取氢化可的松10mg，加甲醇溶解并定容至10mL容量瓶，得质量浓度1.0 g/L的内标贮备液。将多索茶碱和甲泼尼龙标准贮备液用甲醇梯度稀释为质量浓度分别为400，200，100，50，20，10，5 μg /mL 和 240，120，60，30，12，6，3 μg /mL的标准溶液。

2.3 血清样品处理［5］

采集大鼠空白血液，置未加抗凝剂的离心管中，3 000 r/min低温离心5min，分离得空白血清。精密量取空白血清1.0mL，加1.0 g/L的内标贮备液50μL，用甲醇稀释至5.0 mL，涡旋混合1min，4 000 r/min离心15min，取上清液过滤，得血清样品。

2.4 方法学考察

专属性试验：按拟订色谱条件，取大鼠空白血清、空白血清+对照品+内标溶液，依法测定。结果多索茶碱、甲泼尼龙和氢化可的松的保留时间分别为3.761，22.099，13.177min，三者分离良好，且血清中的内源性物质对待测物出峰也不造成干扰。色谱图见图1。

图1 高效液相色谱图

线性关系考察：精密量取空白血清1.0mL，加入多索茶碱和甲泼尼龙的系列标准溶液各0.5mL，按2.3项下方法操作得不同质量浓度（含多索茶碱 0.5，1.0，2.0，5.0，10.0，20.0，40.0 μg /mL和甲泼尼龙 0.3，0.6，1.2，3.0，6.0，12.0，24.0 μg /mL）的血清对照品共7份。按拟订色谱条件测定峰面积，分别以待测物峰面积与内标物峰面积的比值（Y）对待测物和内标物质量浓度（X）进行线性回归。得多索茶碱的回归方程 Y＝0.109 4X+0.005 3，r＝0.999 5；甲泼尼龙的回归方程 Y＝0.175 2X-0.037 2，r＝0.9996。结果表明，多索茶碱和甲泼尼龙质量浓度在0.5～40μg/mL和0.3～24μg/mL（n＝7）范围内与峰面积呈良好线性关系。

精密度试验：在空白血清中加入一定量的待测物的标准溶液，制备高、中、低3个质量浓度待测物的标准血清样品（含多索茶碱和甲泼尼龙分别为 30.0，7.5，1.0 μg/mL 和 20.0，5.0，0.5μg/mL）各5份，按2.3项下方法操作。在24 h内连续测定5次，计算日内精密度；连续测定3 d计算日间精密度。结果见表1，日内和日间 RSD均小于10%，表明仪器精密度良好。

表1 精密度试验结果（n＝5）

稳定性试验：取血清样品，在室温放置6 h，或经过3个冷冻-解冻循环，或-20℃条件下冷冻保存1个月。以待测物测定的质量浓度与实际质量浓度之间的 RSD作为考察指标，其 RSD分别为5.52%，7.13%，4.89%（n＝5），表明处理过的血清样品具有良好的稳定性，血清样品冻融3次和冷藏1个月基本保持稳定。

加样回收试验：制备含多索茶碱和甲泼尼龙质量浓度分别为10μg/mL和 6μg/mL的血清样品 6份，分别加入多索茶碱（400 μg/mL）和甲泼尼龙（240 μg/mL）标准溶液 100，125，150 μL，平行测定2份，按2.3项下方法操作，计算加样回收率［6-7］。结果见表2。

表2 加样回收试验结果（n＝6）

3 讨论

对于同时测定理化性质差异较大的药物，文献报道多集中在采用HPLC梯度洗脱，或采用2种流动相分别洗脱［8-9］，而本方法只采用单种流动相洗脱，从方法上来说更简便快速。本方法的建立，不仅为研究多索茶碱和甲泼尼龙的药代动力学、药物相互作用提供了技术基础，也为建立同时检测其他理化性质存在较大差异的联用药物的血药浓度方法提供了参考。

检测波长的选择：对多索茶碱和甲泼尼龙的甲醇溶液在200～400nm的波长范围内进行紫外扫描，发现多索茶碱在272nm、甲泼尼龙在243 nm波长处有最大吸收峰。综合考虑2个待测物的灵敏度、内标物的响应和血清内源性杂质等影响因素，最终选定260 nm为检测波长。

流动相的选择：对甲醇-水系统与乙腈等其他试剂进行比较，因甲醇廉价易得且安全性较高，对仪器以及色谱柱损害程度小，选择前者；结合多索茶碱和甲泼尼龙的极性相差较大因素，在甲醇∶水（30%→70% ∶70%→30%）范围内试验，进行加酸筛选，最后选定甲醇-0.5%醋酸溶液（54∶46）为流动相。

内标物的选择：因生物样品的药物浓度低，故采用内标法。本试验中对咖啡因、地塞米松、氢化可的松、苯巴比妥、非那西丁、炔诺酮等候选内标物进行了筛选［10］，最后选定保留时间刚好在2种待测物之间、分离良好且在检测波长处响应较好的氢化可的松作为内标物。

生物样品的选择：对空白血浆和空白血清的色谱图进行了分析，发现空白血浆的内源性杂质比空白血清多，特别是在保留时间为5.5min时附近有一较强的吸收峰，且与多索茶碱的吸收峰较为接近，因此选择内源性干扰较少的空白血清作为生物样品。

参考文献：

［1］孙伟，曹志新.慢性阻塞性肺疾病的药物治疗进展［J］.中国临床医生，2013，42（2）:12-14.

［2］陈锋，徐辉.慢性阻塞性肺疾病的治疗进展［J］.现代临床医学，2013，39（3）:227-229.

［3］张冠磊.甲基强的松龙联合多索茶碱治疗COPD急性加重期疗效分析［J］. 现代诊断与治疗，2013，24（6）:1 306-1 307.

［4］胡立新.多索茶碱并小剂量甲强龙治疗慢性阻塞性肺疾病急性发作疗效观察［J］. 浙江临床医学，2011，13（3）:299-300.

［5］翁爱彬，方剑英，郑荔莉.RP-HPLC法同时测多索茶碱和3种抗癫痫药血药浓度［J］. 湖南中医药大学学报，2013，33（6）:79-81.

［6］贾永亮，韩桂茹，李晓燕.高效液相色谱法同时测定抗脑衰胶囊中3种成分含量［J］. 中国药业，2014，23（1）:12-13.

［7］姬雪礼，李文烈，郑晓杰，等.高效液相色谱法同时测定连翘叶中连翘酯苷 A和连翘苷含量［J］. 中国药业，2014，23（7）:33-34.