表没食子儿茶素没食子酸酯调控CDC25A表达与抑制食管癌细胞增殖作用及机制

张利宣，曲 艺

（1.河北医科大学第三医院，河北 石家庄 050000； 2.河北省医学情报研究所，河北 石家庄 050000）

食管癌是较常见的恶性肿瘤［1］，旺盛的增殖能力及无控性生长是恶性肿瘤的共同特点，研究食管癌的发生机制对于食管癌早期诊断及治疗具有重大意义。笔者利用流式细胞术检测食管鳞癌细胞增殖及细胞分裂周期（cell division cycle，CDC）25A蛋白表达水平，探讨细胞增殖与食管癌发生及发展的关系，利用细胞试验研究表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin-3-gallate，EGCG）抑制食管癌细胞Ec9706增殖及调控CDC25A蛋白作用，以期为临床研究低毒、高效的抗食管癌药物提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

试剂与仪器、细胞株：EGCG（美国Sigma公司）；胎牛血清（杭州四季青公司）；碘化丙啶（美国Sigma公司）。鼠抗人CDC25A单克隆抗体（克隆系 DCS-120，美国 Santa Cruz公司）。Epics-XL型流式细胞仪（美国Beckman Coulter公司）。人食管癌Ec9706细胞株（由中国医学科学院肿瘤医院肿瘤研究所分子肿瘤学国家重点实验室惠赠，本实验室传代培养）。接种细胞于含10%胎牛血清的PRMI1640培养基中（补充青霉素、链霉素各100 U/L），培养器皿置37℃含5%CO2的细胞培养箱中。

临床标本：选取河北医科大学第四医院病理科2005年9月至2006年5月手术切除食管癌标本38例，患者术前均未经任何抗癌治疗，均有完整的病理资料。其中男22例，女16例；年龄40～76岁；经病理医师证实均为进展期食管鳞状细胞癌。另取20例切缘正常食管黏膜组织作为对照。标本用70%乙醇固定。

1.2 方法

单细胞悬液制备：将食管癌或正常组织利用网搓法制备单细胞悬液，显微镜下观察细胞形态，保证细胞完整细胞好，细胞碎片少，调整细胞悬液浓度为1×107/mL。

分组及药物干预：取对数生长期的Ec9706细胞1×106接种至细胞培养瓶中，待细胞贴壁后，加入不同质量浓度的EGCG，使终质量浓度分别达到 0，100，200，300mg/L，对照组使用生理盐水代替EGCG（即0mg/LEGCG），作用24 h后，收集细胞，磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤2次，300目尼龙网过滤制备成合格的单细胞悬液，调整细胞悬液浓度为1×107/mL，70%乙醇固定，4℃冰箱放置备检。每组试验重复3次。

细胞增殖检测：Epics-XLⅡ型流式细胞仪（美国Beckman Coulter公司），激发光源为15mW氩离子激光器，激发波长为488nm，应用Expo 32 ADC分析免疫荧光数据，用Muticycle AV分析软件对DNA细胞周期拟合分析。检测前以flow-check TMF luorpheres（10 μm）荧光微球 （REF 6605359.Beckman Coulter，Inc.Fullerton，CA92835.）作为标准样品调整仪器CV值在2%以内。取上述制备的单细胞悬液100μL（含1×106细胞）。冷PBS洗涤细胞1次，去上清，向细胞中加入碘化丙啶500μL，4℃冰箱内避光染色30min，冷PBS洗涤细胞1次，去上清，加1mL PBS悬浮细胞，上流式细胞仪检测。细胞增殖状态以增殖指数（proliferation index，PI）表示，PI＝ （S+G2/M）/（G0/1+S+G2/M）×100%。

细胞CDC25A蛋白表达检测：取制备的单细胞悬液100μL（含1×106细胞），PBS洗涤1次，去上清，向其中加入CDC25A抗体100μL，避光室温放置30 min，PBS洗涤细胞1次，加入羊抗鼠FITC-IgG二抗工作液100μL，避光室温孵育30min，PBS洗涤细胞1次，上机检测前加入PBS 1 mL，经500目铜网过滤后上流式细胞仪检测。CDC25A蛋白表达以平均荧光强度表示。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 食管癌及正常组织细胞增殖及CDC25A蛋白表达水平

食管癌细胞增殖指数为（24.92±11.01）%，与食管正常组织细胞增殖指数（14.49 ±3.83）%相比显著增高（P＜0.05），见图 1。食管癌组织细胞中CDC25A蛋白表达量为（558.201 5±45.673 8）%，与食管正常组织细胞中CDC25A蛋白表达量（508.802 4±53.322 7）%相比显著增高（P＜0.05），见图 2。

图1 流式细胞术检测不同食管组织细胞周期

图2 流式细胞术检测不同食管组织细胞中CDC25A蛋白表达量

2.2 EGCG作用后Ec9706细胞增殖及CDC25A蛋白表达水平

100，200，300mg/LEGCG 作用 24 h后，Ec9706细胞增殖指数分别为（34.14 ±2.06）%，（25.66 ±1.68）%，（18.32 ±1.07）%，与对照组 （41.24±1.13）% 相比显著降低（P＜ 0.05）。300 mg/L EGCG组细胞增殖指数显著低于 100，200 mg/L EGCG组（P＜0.05）。100，200，300mg/LEGCG 作用 Ec9706 细胞 24 h 后，细胞中 CDC25A蛋白表达量分别为 （574.31±4.61）% ，（551.59±6.10）%，（532.70 ±6.42）%，与对照组（595.87 ±3.73）%相比显著降低（P＜0.05）。300mg/LEGCG组细胞中CDC25A蛋白表达量显著低于 100，200mg/LEGCG 组（P＜0.05）。

3 讨论

细胞增殖的紊乱在恶性肿瘤的发生中起着一定作用。细胞增殖受一系列因子的调控［2-3］，细胞周期调控的核心是一组蛋白激酶，即细胞周期蛋白依赖性激（CDKs）［4-5］。它们各自在细胞周期内特定的时间激活，通过对相应底物磷酸化，驱使细胞完成细胞周期。CDKs的激活首先需与cyclin结合成cyclin/CDK复合物，此外还受到几种复杂机制的严格调控，包括细胞周期蛋白（cyclin）、CDK 激活性激酶 （CAK）机制、CDK 抑制物（CKI）机制和Weel/CDC25 机制等［6］。CDC25A是 CDC25 家族成员，研究表明CDC25A在多种肿瘤细胞中高表达，如卵巢癌、乳腺癌等，被认为是癌基因，在细胞周期G1至S期和G2至M期中发挥作用［7-8］。CDC25A过度表达可导致细胞生长失控后恶性转化［9］。本试验结果显示，食管癌细胞增殖呈旺盛状态，且CDC25A蛋白过度表达，提示CDC25A蛋白高表达可能是引起食管癌细胞增殖旺盛的原因之一，并参与了食管癌的发生。

食管癌目前的主要治疗方法包括手术、放射治疗及化学治疗，手术往往是首选的治疗方法，但对于中晚期或由于其他原因不能手术的患者，多选择放射、化学治疗。由于化学治疗药物的高毒副作用及易耐药，效果不佳，故寻找高效低毒的抗食管癌药物，显得格外重要。近年来的研究发现，EGCG是绿茶的提取物，具有低毒副作用的特点，EGCG对多种肿瘤细胞具有生长抑制作用［10］，但用于食管癌的研究尚少见。本试验结果发现，EGCG作用后食管癌细胞增殖受抑制，提示EGCG可以抑制食管癌细胞生长，且可以下调CDC25A的表达水平。EGCG可能通过下调食管癌Ec9706细胞中CDC25A表达，从而抑制食管癌细胞生长，起到抗食管癌作用，且EGCG具有低毒副作用的特点，可作为抗食管癌药物开发，具有广泛的应用前景。

参考文献：

［1］Gamliel Z.Incidence，epidemiology，and etiology of esophageal cancer［J］.Chest Surg Clin N Am，2000，10:441-450.

［2］Aleem E，Kiyokawa H，Kaldis P.Cdc2-cyclinE complexes regulate the G1 /Sphase transition［J］.NatCell Biol，2005，7（8）:831-836.

［3］Slingerland J，Pagano M.Regulation of the cdk inhibitor p27 and its deregulation in cancer［J］.JCell Physiol，2000，183（1）:10-17.

［4］Koff A，Giordano A，Desia D，et al.Formation and activation of a cyclin E-cdk2 complex during the G1 phase of the human cell cycle［J］.Science，1992，257（5 077）:1 689-1 694.

［5］Martin A，Odajima J，Hunt SL，et al.Cdk2 is dispensable for cell cycle inhibitionand tumorsuppressionmediated by p27（Kip1）and p21（Cip1）［J］.Cancer Cell，2005，7（6）:591-598.

［6］Hartwell LH，Kastan.The cell cycle controland cancer［J］.Science，1994，266:1 821-1 834.

［7］Hernandez S，Bessa X，Bea S，et al.Differential expression of cdc25 cellcycle-activating phosphatases in human colorectal carcinoma［J］.Lab Invest Apr，2001，81:465-473.

［8］Evans KL.Overexpression of CDC25Aassociated with poor prognosis in breast cancer［J］.MolMed Today，2000，6:459-465.

［9］Draetta G，Eckstein J.Cdc25 protein phosphatases in cell proliferation［J］.Bioc Biop Acta，1997，1 332:53-63.

［10］Saldanha SN，Kala R，Tollefsbol To.Molecular mechanisms forinhibition of colon cancer cells by combined epigenetic-modulatingepigallocatechin gallate and sodiumbutyrate［J］.Exp Cell Res，2014，324（1）:40-53.